【正文】 k）掩蓋基片，只暴露特定區(qū)域，然后用光照除去暴露區(qū)域活性基團(tuán)上的光敏保護(hù)基團(tuán)，使活性基團(tuán)游離； ? ②加入一種被同樣的光敏保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的核苷酸，并化學(xué)連接到游離的活性基團(tuán)上。 ? 重復(fù)上述步驟，最終制成基因芯片 原位合成法 ? （ 2）微量點(diǎn)樣法： ? 先制備寡核苷酸探針或 cDNA 探針，再用專(zhuān)門(mén)的全自動(dòng)點(diǎn)樣儀按照一定順序點(diǎn)印到基片表面，使探針通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或靜電吸附作用固定于基片上，形成微陣列。 ? 點(diǎn)樣主要有噴墨打印和接觸打印兩種方式。 ① 噴墨打印法是利用壓電晶體或其他技術(shù)將探針溶液通過(guò)微孔噴射到基片表面，產(chǎn)生的液滴體積可以在 1 10－ 9～ 10－ 2μl。 ② 接觸打印法是用較為堅(jiān)硬的點(diǎn)樣針蘸取少量探針溶液，然后接觸基片，在基片表面留下探針斑點(diǎn)。斑點(diǎn)直徑由點(diǎn)樣針、探針溶液和基片表面的性質(zhì)共同決定。 ? 2．樣品制備 ? 樣品制備包括從組織細(xì)胞內(nèi)分離純化 RNA 和基因組 DNA 等樣品、對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。 ? 標(biāo)記物主要是熒光素和生物素等，其中以熒光素最為常用。一般將待測(cè)樣品和對(duì)照樣品分別用 Cy3 和 Cy5 進(jìn)行標(biāo)記，這樣與芯片雜交之后可以清楚地了解兩種樣品中基因表達(dá)的異同。 ? 擴(kuò)增和標(biāo)記可以采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)等。 ? 3．分子雜交 ? 將雜交液滴到芯片上，或?qū)⑿酒腚s交液中，在一定條件下使待測(cè) DNA 與芯片探針陣列進(jìn)行雜交。雜交之后，用漂洗液漂洗芯片，除去末雜交的 DNA。 ? 基因芯片雜交的一個(gè)特點(diǎn)是反應(yīng)體系內(nèi)探針的含量顯著高于待測(cè) DNA 的含量，所以雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與待測(cè) DNA 的含量成正比。 ? 雜交條件將決定雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。雜交條件包括雜交液的離子強(qiáng)度、雜交溫度和雜交時(shí)間等。 ? 在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)探針的長(zhǎng)度、類(lèi)型、所帶電荷、 G/C 含量、芯片類(lèi)型和研究目的等因素，對(duì)雜交條件進(jìn)行優(yōu)化。 ? 4．檢測(cè)分析 ? 用芯片檢測(cè)儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描處理，根據(jù)芯片上每個(gè)位點(diǎn)的探針序列即可知道待測(cè) DNA 的堿基序列，從而獲得待測(cè) DNA 的信息。 ? 檢測(cè)結(jié)果一般可以獲得三種陽(yáng)性雜交圖像： ? ① Cy3（ λex＝ 554nm， λem＝ 568nm）標(biāo)記的待測(cè)樣品與芯片探針結(jié)合，形成紅色雜交點(diǎn)，說(shuō)明待測(cè)樣品中存在探針基因高表達(dá)； ? ② Cy5（ λex＝ 652nm， λem＝ 672nm）標(biāo)記的對(duì)照樣品與芯片探針結(jié)合，形成綠色雜交點(diǎn)，說(shuō)明對(duì)照樣品中存在探針基因高表達(dá)； ? ③兩種待測(cè) DNA 都與芯片探針結(jié)合，形成黃色雜交點(diǎn)，說(shuō)明兩種樣品中都存在探針基因高表達(dá) 基因芯片技術(shù)分析基因表達(dá) 二、應(yīng)用 ? 測(cè)序 ? 應(yīng)用基因芯片進(jìn)行的 DNA 測(cè)序?qū)儆陔s交測(cè)序（ SBH） ? 基本原理是： ? 在芯片上固定一定長(zhǎng)度寡核苷酸所有序列的探針，和待測(cè)序 DNA 雜交。從理論上講，任意待測(cè) DNA 序列都有相應(yīng)探針與之雜交。根據(jù)雜交探針的重疊序列進(jìn)行排列分析，即可確定待測(cè) DNA 序列。 ? 例如，將含有全部 8nt 探針（ 48＝ 65,536 種）的芯片與一個(gè) 12 nt 的待測(cè) DNA 片段雜交之后，檢測(cè)出有 5 個(gè)雜交位點(diǎn)。將這 5 個(gè)雜交位點(diǎn)的探針按照其重疊序列進(jìn)行排列，可以確定 12 nt 序列為 AGCCTAGCTGAA 12 nt 待測(cè) DNA序列為 AGCCTAGCTGAA ? ? 研究基因表達(dá)是目前基因芯片應(yīng)用最多的一個(gè)領(lǐng)域。例如腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的基因表達(dá)存在著明顯差異，涉及眾多基因的異常表達(dá)。應(yīng)用基因芯片可以方便地揭示腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的基因表達(dá)在 mRNA 水平上的差異。應(yīng)用人類(lèi)基因表達(dá)譜芯片 檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)差異，選擇差異顯著的基因作為腫瘤標(biāo)志，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，從而建立一種新的腫瘤分類(lèi)方法。 ? ? 基因芯片技術(shù)是基因診斷的核心技術(shù)，可以用于診斷腫瘤、遺傳病、傳染病，特別適合于產(chǎn)前診斷、群體篩查。目前已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)有艾滋病病毒芯片 ——可以診斷是否攜帶艾滋病病毒 HIV1， p53 芯片 ——可以分析患腫瘤的可能性，P450 芯片 ——可以診斷是否有藥物代謝缺陷。 ? ? 同一種藥物對(duì)于不同患者在療效和副作用方面會(huì)有很大差異，一定劑量的某種藥物對(duì)甲患者有效，對(duì)乙患者卻不起作用，對(duì)丙患者甚至?xí)懈弊饔?。?dǎo)致對(duì)藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要基礎(chǔ)是 患者的遺傳學(xué)背景 存在種族差異和個(gè)體差異，這種差異主要體現(xiàn)在 DNA 的單核苷酸多態(tài)性（ SNP）上。基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分析單核苷酸多態(tài)性，可以在人的基因組中大規(guī)模篩選新的單核苷酸多態(tài)性。經(jīng)過(guò)基因診斷之后，可以針對(duì)不同基因型采取不同的用藥劑量，使臨床用藥個(gè)體化，降低藥物的毒副作用，獲得最佳療效。 ? ? 由于中藥具有多成分、多途徑、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，用芯片技術(shù)研究中藥優(yōu)勢(shì)巨大?；蚪M學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)、DNA 指紋圖譜等在中藥研究中的應(yīng)用都要利用基因芯片技術(shù)來(lái)完成。 ? （ 1）藥材鑒別： ? 利用基因芯片可以鑒定不同產(chǎn)地甚至不同季節(jié)藥用植物 /動(dòng)物的品種和質(zhì)量。 ? （ 2）中藥篩選： ? 利用基因芯片可以分析給藥前后基因表達(dá)譜的變化，分析病理生理學(xué)原因，從中藥成分中篩選先導(dǎo)化合物，大量減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究工作量，加快中藥新藥的研制步伐。 ? （ 3）毒性評(píng)價(jià)： ? 和其他藥物一樣，中藥在發(fā)揮藥效的同時(shí)也可能干擾細(xì)胞的正常代謝而具有毒副作用?；蛐酒梢愿咄糠治鏊幬飳?duì)培養(yǎng)細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物正常代謝的影響，從而在分子水平評(píng)估藥物的毒副作用，比傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)。