核酸雜交技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-01-19 22:17本頁面
【正文】 k）掩蓋基片，只暴露特定區(qū)域，然后用光照除去暴露區(qū)域活性基團上的光敏保護基團，使活性基團游離； ? ②加入一種被同樣的光敏保護基團保護的核苷酸，并化學連接到游離的活性基團上。 ? 重復上述步驟，最終制成基因芯片 原位合成法 ? （ 2）微量點樣法： ? 先制備寡核苷酸探針或 cDNA 探針，再用專門的全自動點樣儀按照一定順序點印到基片表面，使探針通過共價交聯(lián)或靜電吸附作用固定于基片上，形成微陣列。 ? 點樣主要有噴墨打印和接觸打印兩種方式。 ① 噴墨打印法是利用壓電晶體或其他技術(shù)將探針溶液通過微孔噴射到基片表面，產(chǎn)生的液滴體積可以在 1 10－ 9～ 10－ 2μl。 ② 接觸打印法是用較為堅硬的點樣針蘸取少量探針溶液，然后接觸基片，在基片表面留下探針斑點。斑點直徑由點樣針、探針溶液和基片表面的性質(zhì)共同決定。 ? 2．樣品制備 ? 樣品制備包括從組織細胞內(nèi)分離純化 RNA 和基因組 DNA 等樣品、對樣品進行擴增和標記。 ? 標記物主要是熒光素和生物素等，其中以熒光素最為常用。一般將待測樣品和對照樣品分別用 Cy3 和 Cy5 進行標記，這樣與芯片雜交之后可以清楚地了解兩種樣品中基因表達的異同。 ? 擴增和標記可以采用逆轉(zhuǎn)錄反應和聚合酶鏈反應等。 ? 3．分子雜交 ? 將雜交液滴到芯片上，或?qū)⑿酒腚s交液中，在一定條件下使待測 DNA 與芯片探針陣列進行雜交。雜交之后，用漂洗液漂洗芯片，除去末雜交的 DNA。 ? 基因芯片雜交的一個特點是反應體系內(nèi)探針的含量顯著高于待測 DNA 的含量，所以雜交信號的強弱與待測 DNA 的含量成正比。 ? 雜交條件將決定雜交結(jié)果的準確性。雜交條件包括雜交液的離子強度、雜交溫度和雜交時間等。 ? 在實際工作中，應根據(jù)探針的長度、類型、所帶電荷、 G/C 含量、芯片類型和研究目的等因素，對雜交條件進行優(yōu)化。 ? 4．檢測分析 ? 用芯片檢測儀對芯片進行掃描處理，根據(jù)芯片上每個位點的探針序列即可知道待測 DNA 的堿基序列，從而獲得待測 DNA 的信息。 ? 檢測結(jié)果一般可以獲得三種陽性雜交圖像： ? ① Cy3（ λex＝ 554nm， λem＝ 568nm）標記的待測樣品與芯片探針結(jié)合，形成紅色雜交點，說明待測樣品中存在探針基因高表達； ? ② Cy5（ λex＝ 652nm， λem＝ 672nm）標記的對照樣品與芯片探針結(jié)合，形成綠色雜交點，說明對照樣品中存在探針基因高表達； ? ③兩種待測 DNA 都與芯片探針結(jié)合，形成黃色雜交點，說明兩種樣品中都存在探針基因高表達 基因芯片技術(shù)分析基因表達 二、應用 ? 測序 ? 應用基因芯片進行的 DNA 測序?qū)儆陔s交測序（ SBH） ? 基本原理是： ? 在芯片上固定一定長度寡核苷酸所有序列的探針，和待測序 DNA 雜交。從理論上講，任意待測 DNA 序列都有相應探針與之雜交。根據(jù)雜交探針的重疊序列進行排列分析，即可確定待測 DNA 序列。 ? 例如，將含有全部 8nt 探針（ 48＝ 65,536 種）的芯片與一個 12 nt 的待測 DNA 片段雜交之后，檢測出有 5 個雜交位點。將這 5 個雜交位點的探針按照其重疊序列進行排列，可以確定 12 nt 序列為 AGCCTAGCTGAA 12 nt 待測 DNA序列為 AGCCTAGCTGAA ? ? 研究基因表達是目前基因芯片應用最多的一個領域。例如腫瘤細胞與正常細胞的基因表達存在著明顯差異，涉及眾多基因的異常表達。應用基因芯片可以方便地揭示腫瘤細胞和正常細胞的基因表達在 mRNA 水平上的差異。應用人類基因表達譜芯片 檢測不同腫瘤細胞的基因表達差異，選擇差異顯著的基因作為腫瘤標志，可以對腫瘤進行分類和鑒定，從而建立一種新的腫瘤分類方法。 ? ? 基因芯片技術(shù)是基因診斷的核心技術(shù)，可以用于診斷腫瘤、遺傳病、傳染病，特別適合于產(chǎn)前診斷、群體篩查。目前已經(jīng)成功開發(fā)有艾滋病病毒芯片 ——可以診斷是否攜帶艾滋病病毒 HIV1， p53 芯片 ——可以分析患腫瘤的可能性，P450 芯片 ——可以診斷是否有藥物代謝缺陷。 ? ? 同一種藥物對于不同患者在療效和副作用方面會有很大差異，一定劑量的某種藥物對甲患者有效，對乙患者卻不起作用，對丙患者甚至會有副作用。導致對藥物反應個體差異的主要基礎是 患者的遺傳學背景 存在種族差異和個體差異，這種差異主要體現(xiàn)在 DNA 的單核苷酸多態(tài)性（ SNP）上。基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分析單核苷酸多態(tài)性，可以在人的基因組中大規(guī)模篩選新的單核苷酸多態(tài)性。經(jīng)過基因診斷之后，可以針對不同基因型采取不同的用藥劑量，使臨床用藥個體化，降低藥物的毒副作用，獲得最佳療效。 ? ? 由于中藥具有多成分、多途徑、多系統(tǒng)、多靶點的作用特點，用芯片技術(shù)研究中藥優(yōu)勢巨大?；蚪M學及轉(zhuǎn)錄組學、DNA 指紋圖譜等在中藥研究中的應用都要利用基因芯片技術(shù)來完成。 ? （ 1）藥材鑒別： ? 利用基因芯片可以鑒定不同產(chǎn)地甚至不同季節(jié)藥用植物 /動物的品種和質(zhì)量。 ? （ 2）中藥篩選： ? 利用基因芯片可以分析給藥前后基因表達譜的變化，分析病理生理學原因，從中藥成分中篩選先導化合物，大量減少動物實驗和臨床研究工作量，加快中藥新藥的研制步伐。 ? （ 3）毒性評價： ? 和其他藥物一樣，中藥在發(fā)揮藥效的同時也可能干擾細胞的正常代謝而具有毒副作用?；蛐酒梢愿咄糠治鏊幬飳ε囵B(yǎng)細胞或?qū)嶒瀯游镎４x的影響，從而在分子水平評估藥物的毒副作用，比傳統(tǒng)的動物實驗準確、快速、經(jīng)濟、省時。
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