核酸電泳ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 01:09本頁面
【正文】 將玻璃板斜靠在物體上，使 成 10176。 角，可減少液體泄漏的機會 . ，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入 緩沖液 . ，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳 子上吸附的及凝膠頂部未聚合 的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后 DNA電泳帶型不規(guī)則 . DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時不 要產(chǎn)生氣泡 . ，電壓為 18V/cm，進行電泳 . . ，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻 璃板上 .浸入含 ， 15～ 30min后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果 . 10ng以上量的 DNA條帶 .要求更高 的靈敏度，可用銀染 . 同濃度丙烯酰胺和 DNA的 有效分離范圍（表 3） 丙烯酰胺 (%) 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭 * 二甲苯青 * 100～ 2022 100 460 80～ 500 65 260 60～ 400 45 160 40～ 200 30 70 25～ 150 15 60 10～ 100 12 45 *表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈 DNA分子所含堿基對數(shù)目 (bp). DNA染色 : a. 溴化乙錠 (Ethidium bromide， EB) 在凝放電泳中，加入溴化乙錠染料對核酸分子染色之后 (凝膠電泳液中加入終濃度為 ) 。將電泳標本放置在紫外光下觀察．便可以十分敏感而方便地檢測出凝膠介質(zhì)中 DNA的譜帶部位．即使每條 DNA帶中僅含有 DNA．也可以被清晰地段現(xiàn)出來。 溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料．可以插入列 DNA或 RNA分子的堿基之間。并在 302nm波長的紫外光照射下有最大紅色熒光 (590nm)發(fā)出。 EB的突出缺點： 為中度毒性的強誘變劑 (302nm透照， 254nm外照 ) 電泳載樣緩沖液 (Loading buffer): 核酸電泳常用的指示劑有 溴酚蘭 和 二甲苯青 及銀染色 . 溴酚蘭 在堿性液體中呈紫蘭色，在 %、 1%、 %和 2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與 1Kb、 、 DNA片段大致相同 . 二甲苯青 的水溶液呈蘭色，它在 1%和 %瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與 2Kb和 DNA大致相似 . 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖 400組成 載樣緩沖液 . 載樣緩沖液的作用有 : ① 增加樣 品密度，使其比重增加，以確保 DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 。 ② 在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置 。 ③ 使樣品呈色，使加樣操作更方便 . : 銀染色液中的銀離子 (Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使 Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比 EB高 200倍 .但銀染色后， DNA不宜回收 . c. SYBR Green I A minor groove binding dye Initial Phase Exponential Phase Plateau Phase (Pulsed field gel electrophoresis， PFGE) 在電場的作用下 DNA可進入較小的瓊脂糖凝膠孔中，大的分子只能進入大的膠孔，但需要較長的時間方能找到可進入的膠孔，所以泳動軌跡彎曲，速度緩慢。 大于 30kb和 DNA分子在電泳中只能頭尾牽引進入膠孔，需定期改變電場方向使大分子通過凝膠孔。 每改變一次大的伸展的 DNA分子重新定向，在新的方向上通過凝膠。通過不斷交替改變電場方向，選擇恰當?shù)拿}沖時間等條件，可將 35－ 10000kb的 DNA分子在凝膠中予以分辨。 像大腸桿茵這樣的原核生物 , 其染色體基因組 DNA的長度超過 4000kb。哺乳動物主要組織相容性基因座 (locus)所占的 DNA長度亦達數(shù)千 kb。由此可見 , 運用普通的凝膠電泳技術(shù)顯然是無法分離如此超大分子量的 DNA分子的。 1984年 , (PFGE)技?？梢猿晒Φ赜脕矸蛛x整條染色體這樣的超大分子量的 DNA分子。 在標準的脈沖電場凝膠電泳中、頭一個脈沖的電場方向與核酸移動方向成 45度夾角，而下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)亦成 45度夾角。 由于加壓在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小及作用時間都在交替地變換著，使得 DNA分子能夠隨時地調(diào)整其游動方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量較小的 DNA分子相比、分子量較大的 DNA分子需要更多次地更換其構(gòu)型和方位，以使其可以按新的方向游動。 因此，在瓊脂糖介質(zhì)中的遷移速率顯得更慢一些，從而達到了分離超大分子量 DNA分子的目的。 Contourclamped homogeneous electric field (CHEF) (Chu, et al., 1986, 1990) Increased separation of the 2050 kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE) 鉗位均勻電場凝膠電泳 倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳
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