凝膠電泳ppt課件(2)-資料下載頁
2025-05-02 12:02本頁面
【正文】 過堿變性處理及相應(yīng)的中和處理。 Northern印跡雜交法和 Southern印跡雜交法有何不同 Western雜交 Western blotting是用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或其它支持物上 ， 然后同放射性同位素標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)廣泛用于基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)研究。 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點(diǎn)印跡雜交（ dot blotting）和狹線印跡雜交（ slot blotting ）是在 Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（ DNA和 RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。 通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。 菌落雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的 DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有 DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的 DNA或 RNA探針雜交。 鑒定重組子。 檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù) 核酸原位雜交 (in situ hybridization) ：將標(biāo)記的探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交檢測的方法。 ： 能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究 不需從組織或細(xì)胞中提取核酸 能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài) 核酸原位雜交的基本步驟 ：載玻片 用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì) (Fluorescence in situ Hybridization； FISH) 基本原理是將 DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來檢測 DNA序列在染色體上的定位。 (multicolor FISH。 mFISH ) (Comparative Genomic Hybridization； CGH ) 由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù) (Comparative Genomic Hybridization； CGH ) 利用 兩種 不同的 熒 光分別 標(biāo)記兩種 不同細(xì)胞的Genomic DNA ，再同 時(shí)與 正常的染色 體進(jìn) 行hybridization，染色 體 上不同 熒 光 間 的 強(qiáng) 弱比值，由 此 比 較 而 觀察 基因 組 中特定基因的拷 貝數(shù)變化 。 CGH主要用于檢測腫瘤組織 DNA拷貝數(shù)變化（缺失、復(fù)制、擴(kuò)增），并能將這些異常在染色體上定位。該方法通過同一次實(shí)驗(yàn)即可掃描整個(gè)腫瘤基因組 DNA序列的增加或丟失。 液相雜交 待測核酸分子與探針在雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，分離雜交雙鏈和單鏈 RNA，再進(jìn)行檢測。 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶 S1保護(hù)分析法 探針及探針的標(biāo)記 ? 探針：分子雜交中 被標(biāo)記 的 已知序列 的核酸片斷稱為探針。 ? （ 1）探針的種類： ? 根據(jù)探針的標(biāo)記物不同：放射性探針和非放射性探針； ? 根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同：分為 DNA探針，RNA探針， cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。 ? Western雜交中的抗體被看作探針。 （ 2）探針的標(biāo)記： i） 標(biāo)記物 同位素標(biāo)記： 32P、 35S、 3H等 非同位素標(biāo)記：生物素、地高辛、熒光素等 ii）標(biāo)記方法 a 均勻標(biāo)記 b末端標(biāo)記 帶有放射性的已知序列的核酸片斷 標(biāo)記 已知序列的核酸片斷 5’ 標(biāo)記 已知序列的核酸片斷 3’ a 切口平移法 (nick translation)：大腸桿菌的 DNA聚合酶Ⅰ b 隨機(jī)引物法 (random primer)：六核苷酸殘基的引物 c PCR擴(kuò)增標(biāo)記法 : d末端標(biāo)記法 : 5ˊ 3ˊ 3ˊ 5ˊ 5ˊ 3ˊ 5ˊ 3ˊ 5ˊ 5ˊ PCR擴(kuò)增法標(biāo)記示意圖 T4多核苷酸磷酸激酶（ T4PNP） T4PNP的基本特性：在 DNA、 RNA、 dNR、 NR的 5ˊOH上加磷 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP 3 ˊ HO p 5 ˊ 5 ˊ p HO 3 ˊ a. 放射性標(biāo)記的 優(yōu)缺點(diǎn)： 制作簡單、 高比放射性、 放射自顯影效果好。 優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)： 半衰期短（ 32P只有 ）、 不易保存、 對人體有害。 要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作。 （ 3）標(biāo)記物及其檢測 ： 地高辛標(biāo)記 ? 地高辛可以與 dNTP連接成地高辛 dUTP( UTP)等，參入 DNA(RNA)的合成過程，形成地高辛標(biāo)記的DNA(RNA)探針。 ? 利用抗地高辛的抗體通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)來完成。 探針檢測原理 地高辛 探針序列 待測基因 地高辛抗體 酶 底物 產(chǎn)物 探針 DNA用 地高辛 標(biāo)記。 地高辛抗體與 酶 偶聯(lián)。 酶 催化一個(gè) 顯色反應(yīng) 。 地高辛抗體 與 地高辛結(jié)合 。 偶聯(lián)酶及其底物 酶： 堿性磷酸酶 （ Alkaline Phosphatase, AP） 催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程生成 有色的產(chǎn)物 。 酶的作用 ： AP的顯色反應(yīng)底物 (4) 單鏈探針的獲取 f1ori lacZ’ PT7 MCS pBluescript PT3 2958 bp Apr 探針的純化 G50 柱層析法 蛋白質(zhì) /DNA、蛋白質(zhì) /RNA雜交技術(shù) 四 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法
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