【正文】 血凝素 血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分 血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖 PreALB：前白蛋白； HP：觸珠蛋白； α1脂蛋白； ALB：白蛋白； TRF：轉鐵蛋白 βLIP： β脂蛋白； AAT：抗胰蛋白酶； AAG：酸糖蛋白；α2M： α2巨球蛋白 ?免疫電泳沉淀線的數目和分辨率受許多因素影響： ? 首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應一樣，要預測抗體與抗原的最適比； ? 其次是抗血清的抗體譜，一只動物的抗血清往往缺乏某些抗體，如將幾只動物或幾種動物的抗血清混合使用，則效果更好； ? 電泳條件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。 ? 對于免疫電泳的分析，更重要的是經驗的積累，只有多看，多對比分析，才能作出恰當的結論。 ?免疫電泳目前大量應用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別等方面。 對流免疫電泳 ?對流免疫電泳是定向加 速度的免疫雙擴散技術。 ?其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側各孔加入待測抗原，右側孔內放入相應抗體，抗原在陰極側，抗體在陽極側。通電后，帶負電荷的抗原泳向陽極抗體側，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側，在兩者之間或抗體的另一側（抗原過量時）形成沉淀線。 火箭免疫電泳 ?又稱單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術，實質上是加速度的單向擴散。 ?在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，用橫距2～ 3mA/cm的電流強度進行電泳。 火箭電泳圖 ①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原 ?抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭。 ?抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。 火箭電泳操作時應注意以下幾點： 1．所用瓊脂可選擇無電滲或電滲很小的，否則火箭形狀不規(guī)則。 2．注意電泳終點時間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達終點。 3．標本數量多時，電泳板應先置電泳槽上，搭橋并開啟電源（電流要?。┖笤偌訕?。否則易形成寬底峰形，使定量不準。 4．作 IgG定量時，由于抗原和抗體的性質相同，火箭峰因電滲呈紡綞狀。為了糾正這種現象，可用甲醛與 IgG上的氨基結合（甲?；?，使本來帶兩性電荷的 IgG變?yōu)橹粠щ姾?，加快了電泳速度，抵消了電滲作用，而出現伸向陽極的火箭峰。 5．火箭電泳作為抗原定量只能測定 μg/ml以上的含量，如低于此水平則難于形成可見的沉淀峰。加入少量 125I標記的標準抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的放射自顯影技術。根據自顯影火箭峰降低的程度（競爭法）可計算出抗原的濃度。放射免疫自顯影技術可測出 ng/ml的抗原濃度。 免疫固定電泳 ? 免疫固定電泳（ immunofixationelectrophoresis， IFE）是Alper和 Johnson（ 1969）推薦的一項有實用價值的電泳加沉淀反應技術?？捎糜诟鞣N蛋白質的鑒定。 ? 原理類似免疫電泳，不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質區(qū)帶表面，或將浸有抗血清的濾紙貼于其上，抗原與對應抗體直接發(fā)生沉淀反應，形成的復合物嵌于固相支持物中。將未結合的游離抗原或抗體洗去，則出現被結合固定的某種蛋白。 ? 區(qū)帶電泳支持物選用濾紙、醋纖膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。 放射免疫對流電泳 ?將放射性元素標記的抗體（或抗原）與相應的抗原（或抗體）沉淀時，沉淀線通過自顯影而證實。 ?能檢出肉眼看不見的沉淀線，從而提高反應的敏感性，這種方法可應用于凝膠中的所有反應。 酶標對流免疫電泳 ?利用酶標記抗原（抗體）和待測抗體（抗原）在電場中向一定方向移動，在比例適當的地方形成沉淀線，通過酶作用底物而顯色，指示沉淀線的存在。 ?敏感性大大高于對流免疫電泳。 免疫電泳結果分析 1．常見的沉淀弧 ? 由于經電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴散，而相應的抗體呈直線擴散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常見的弧形如下： ? ①交叉弧：表示兩個抗原成分的遷移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示兩個不同的抗原成分，它們的遷移率相同，但擴散率不同；③加寬?。阂话闶怯捎诳乖^量所致；④分枝?。阂话闶怯捎诳贵w過量；⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽，一般由于抗原過量，在白蛋白位置處形成；⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。 2．沉淀弧的曲度 ?勻質性的物質具有明確的遷移率，能生成曲度較大的沉淀弧。 ?有較寬遷移范圍的物質，其沉淀弧曲度較小。 3．沉淀的清晰度 ?沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關，也與抗體的來源有關。 ?抗血清多來源于兔、羊、馬。兔抗體的特點是形成沉淀線寬而淡，抗體過量對沉淀線影響較小，而抗原過量，沉淀線發(fā)生部分溶解。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰，抗原或抗體過量時，復合物沉淀溶解、消失，而且產生繼發(fā)性的非特異性沉淀。因此使用抗原抗體時，一定要找好適當的比例。 4．沉淀弧的位置 ?高分子量的物質擴散慢，所形成的沉淀線離抗原孔較近； ?分子量較小的物質，擴散速度快，沉淀弧離抗體槽近一些。 ?抗原濃度高沉淀弧偏近抗體槽 . ?抗體濃度過高，沉淀弧偏近抗原孔。 注意事項 1．免疫電泳分析法的成功與否，主要取決于抗血清的質量。抗血清中必須含有足夠的抗體，才能同被檢樣品中所有抗原物質生成沉淀反應。 2．抗血清雖然含有對所有抗原物質的相應抗體，但抗體效價有高有低，因此要適當考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。 3．免疫電泳要求分析的物質一方為抗原，另一方為沉淀反應性抗體。因此沒有抗原性的物質或抗原性差的物質、非沉淀反應性抗體，均不能用免疫電泳進行分析。 細胞電泳（ cell electrophoresis） ?在一定 pH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動，這種現象稱為細胞電泳。引起細胞電泳的電位值稱為 ξ電位。 ?各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。尚可用來分離不同種類的細胞，例如可把淋巴樣細胞與造血細胞分開。 ?恒定的電場下，同種細胞的電泳速度相當穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的 ξ電位。 ?ξ電位常因細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價值。 電泳應用法 ion（ t） ophoretic administration， electrophoretic administration ?這是一種為了給單個細胞的膜表面加藥而采用的方法。在尖端極細（數微米以下）的小玻璃吸量管中加上藥液，當給吸量管通電時，藥物離子和中性分子便分別通過電泳和電滲透向吸量管尖端移動而被釋放出來。 ?如果把吸量管放在離細胞表面幾微米的地方，在一定的時間里就會對該細胞施予定量的藥物。 ?此法和微電極記錄法結合起來，在研究諸如化學遞質和各種物質的作用方面是非常有效的。 如 1：肌纖維對乙酰膽堿的感受性只局限于終板部位，用此法能檢查出僅僅離開終板 5微米地方對乙酰膽堿的感受性降到 1／ 10以下。 如 2：做中樞神經系統(tǒng)的實驗是不能直接觀察的，所以通常都是把記錄電極和吸量管連結起來進行實驗。在運用這種方法的過程中，還可以把 2~5個藥液吸量管連結起來，研究 2~5種藥物對同一細胞的效應。 差異凝膠電泳 ? 將樣品在電泳前標記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料 ,然后將標記后的 3 種樣品混合 , 同時在一塊膠上進行電泳 ,即為差異凝膠電泳 (DIGE) 。 ? 所得到的 2D 膠圖像可使用 3 種不同的激發(fā) P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號 ,根據這些信號的比例來判斷樣品之間蛋白質的差異 ,這樣可避免在匹配時出現的誤差 ,進行定量分析時也不依賴于膠與膠之間的重復性。 ? 用于標記的熒光基團在化學結構上相似 ,分子量也基本相同 ,都帶有正電荷 ,所以在與賴氨酸殘基反應時 ,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。 第六節(jié) 電泳測純技術 ?農作物種子品種純度是種子質量評價的主要指標之一，為了解決農作物種子純度和品種真實性鑒定問題，近年來大量電泳測純技術應用在農作物種子品種純度鑒定中。 ?種子電泳技術是通過蛋白質或同工酶的分子大小和電荷數量或兩項同時具有的差異進行分離，并形成不同電泳圖譜而顯示種和品種之間差異的有效方法。 ?醇溶蛋白質電泳技術、酸溶蛋白質電泳技術、鹽溶蛋白質電泳技術、酯酶同工酶電泳技術等技術先后出現，并應用于水稻、玉米、蔬菜、雜交油菜種子純度鑒定試驗，均有成功的報導。 ?等電聚焦電泳技術出現后，因其譜帶清晰、分辨率高而備受歡迎，但由于其成本高、時間長、技術難度大，難以推廣等缺點，嚴重制約了它在種子測純中的應用。 ?為了進一步推動電泳技術在種子純度鑒定中的推廣應用，國際種子檢驗協(xié)會（ ISTA）品種技術委員會于 1983年成立生化測定工作組，致力于總結和發(fā)展種子測純電泳技術。 ?1986年 ISTA正式頒布了“醇溶蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）鑒定品種的程序”并列入 《 1993國際種子檢驗規(guī)程 》 ，我國也將其納入 GB/T35431995《 農作物種子檢驗規(guī)程 》 。 ?1998年全國農業(yè)技術推廣服務中心組織北京、山西、吉林等 12家種子檢驗單位成立項目組，在對現行的各種電泳純度鑒定方法進行分析的基礎上，選定鹽溶蛋白電泳、醋酸尿素蛋白電泳和酯酶同工酶電泳三種電泳方法進行攻關研究，最終于2022年 11月出臺了農業(yè)行業(yè)標準 NY/T449— 2022《 玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法 》 。 ?農業(yè)部農作物種子質量監(jiān)督檢驗測試中心 (太原 )作為全國玉米種子電泳測純技術項目協(xié)作攻關單位之一，已廣泛開展了玉米、小麥種子純度電泳檢測工作，年檢測樣品量約 300份，為政府和企業(yè)決策提供了充分的依據。 ?目前主要應用于農作物品種純度鑒定的電泳方法有四種：蛋白質 PAGE（小麥、大麥、玉米、大豆、水稻等）、 SDS PAGE（玉米、西瓜等）、等電聚焦電泳（玉米、菜豆、水稻、大豆、蔬菜等）和淀粉凝膠電泳（玉米等）。