【正文】 血凝素 血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分 血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖 PreALB：前白蛋白； HP：觸珠蛋白； α1脂蛋白； ALB：白蛋白； TRF：轉(zhuǎn)鐵蛋白 βLIP： β脂蛋白； AAT：抗胰蛋白酶； AAG：酸糖蛋白；α2M： α2巨球蛋白 ?免疫電泳沉淀線的數(shù)目和分辨率受許多因素影響： ? 首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應(yīng)一樣，要預(yù)測抗體與抗原的最適比； ? 其次是抗血清的抗體譜，一只動(dòng)物的抗血清往往缺乏某些抗體，如將幾只動(dòng)物或幾種動(dòng)物的抗血清混合使用，則效果更好； ? 電泳條件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。 ? 對于免疫電泳的分析，更重要的是經(jīng)驗(yàn)的積累，只有多看，多對比分析，才能作出恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。 ?免疫電泳目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別等方面。 對流免疫電泳 ?對流免疫電泳是定向加 速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù)。 ?其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽極側(cè)。通電后，帶負(fù)電荷的抗原泳向陽極抗體側(cè)，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在兩者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過量時(shí)）形成沉淀線。 火箭免疫電泳 ?又稱單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。 ?在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距2～ 3mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳。 火箭電泳圖 ①②③為標(biāo)本；④⑤⑥為標(biāo)準(zhǔn)抗原 ?抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭。 ?抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。 火箭電泳操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 1．所用瓊脂可選擇無電滲或電滲很小的，否則火箭形狀不規(guī)則。 2．注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達(dá)終點(diǎn)。 3．標(biāo)本數(shù)量多時(shí)，電泳板應(yīng)先置電泳槽上，搭橋并開啟電源（電流要?。┖笤偌訕?。否則易形成寬底峰形，使定量不準(zhǔn)。 4．作 IgG定量時(shí)，由于抗原和抗體的性質(zhì)相同，火箭峰因電滲呈紡綞狀。為了糾正這種現(xiàn)象，可用甲醛與 IgG上的氨基結(jié)合（甲?；贡緛韼尚噪姾傻?IgG變?yōu)橹粠щ姾?，加快了電泳速度，抵消了電滲作用，而出現(xiàn)伸向陽極的火箭峰。 5．火箭電泳作為抗原定量只能測定 μg/ml以上的含量，如低于此水平則難于形成可見的沉淀峰。加入少量 125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的放射自顯影技術(shù)。根據(jù)自顯影火箭峰降低的程度（競爭法）可計(jì)算出抗原的濃度。放射免疫自顯影技術(shù)可測出 ng/ml的抗原濃度。 免疫固定電泳 ? 免疫固定電泳（ immunofixationelectrophoresis， IFE）是Alper和 Johnson（ 1969）推薦的一項(xiàng)有實(shí)用價(jià)值的電泳加沉淀反應(yīng)技術(shù)。可用于各種蛋白質(zhì)的鑒定。 ? 原理類似免疫電泳，不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，或?qū)⒔锌寡宓臑V紙貼于其上，抗原與對應(yīng)抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白。 ? 區(qū)帶電泳支持物選用濾紙、醋纖膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。 放射免疫對流電泳 ?將放射性元素標(biāo)記的抗體（或抗原）與相應(yīng)的抗原（或抗體）沉淀時(shí)，沉淀線通過自顯影而證實(shí)。 ?能檢出肉眼看不見的沉淀線，從而提高反應(yīng)的敏感性，這種方法可應(yīng)用于凝膠中的所有反應(yīng)。 酶標(biāo)對流免疫電泳 ?利用酶標(biāo)記抗原（抗體）和待測抗體（抗原）在電場中向一定方向移動(dòng)，在比例適當(dāng)?shù)牡胤叫纬沙恋砭€，通過酶作用底物而顯色，指示沉淀線的存在。 ?敏感性大大高于對流免疫電泳。 免疫電泳結(jié)果分析 1．常見的沉淀弧 ? 由于經(jīng)電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴(kuò)散，而相應(yīng)的抗體呈直線擴(kuò)散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常見的弧形如下： ? ①交叉?。罕硎緝蓚€(gè)抗原成分的遷移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示兩個(gè)不同的抗原成分，它們的遷移率相同，但擴(kuò)散率不同；③加寬?。阂话闶怯捎诳乖^量所致；④分枝?。阂话闶怯捎诳贵w過量；⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽，一般由于抗原過量，在白蛋白位置處形成；⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。 2．沉淀弧的曲度 ?勻質(zhì)性的物質(zhì)具有明確的遷移率，能生成曲度較大的沉淀弧。 ?有較寬遷移范圍的物質(zhì)，其沉淀弧曲度較小。 3．沉淀的清晰度 ?沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關(guān)，也與抗體的來源有關(guān)。 ?抗血清多來源于兔、羊、馬。兔抗體的特點(diǎn)是形成沉淀線寬而淡，抗體過量對沉淀線影響較小，而抗原過量，沉淀線發(fā)生部分溶解。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰，抗原或抗體過量時(shí)，復(fù)合物沉淀溶解、消失，而且產(chǎn)生繼發(fā)性的非特異性沉淀。因此使用抗原抗體時(shí)，一定要找好適當(dāng)?shù)谋壤? 4．沉淀弧的位置 ?高分子量的物質(zhì)擴(kuò)散慢，所形成的沉淀線離抗原孔較近； ?分子量較小的物質(zhì)，擴(kuò)散速度快，沉淀弧離抗體槽近一些。 ?抗原濃度高沉淀弧偏近抗體槽 . ?抗體濃度過高，沉淀弧偏近抗原孔。 注意事項(xiàng) 1．免疫電泳分析法的成功與否，主要取決于抗血清的質(zhì)量?？寡逯斜仨毢凶銐虻目贵w，才能同被檢樣品中所有抗原物質(zhì)生成沉淀反應(yīng)。 2．抗血清雖然含有對所有抗原物質(zhì)的相應(yīng)抗體，但抗體效價(jià)有高有低，因此要適當(dāng)考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。 3．免疫電泳要求分析的物質(zhì)一方為抗原，另一方為沉淀反應(yīng)性抗體。因此沒有抗原性的物質(zhì)或抗原性差的物質(zhì)、非沉淀反應(yīng)性抗體，均不能用免疫電泳進(jìn)行分析。 細(xì)胞電泳（ cell electrophoresis） ?在一定 pH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為 ξ電位。 ?各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動(dòng)速度不同。尚可用來分離不同種類的細(xì)胞，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。 ?恒定的電場下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的 ξ電位。 ?ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。 電泳應(yīng)用法 ion（ t） ophoretic administration， electrophoretic administration ?這是一種為了給單個(gè)細(xì)胞的膜表面加藥而采用的方法。在尖端極細(xì)（數(shù)微米以下）的小玻璃吸量管中加上藥液，當(dāng)給吸量管通電時(shí)，藥物離子和中性分子便分別通過電泳和電滲透向吸量管尖端移動(dòng)而被釋放出來。 ?如果把吸量管放在離細(xì)胞表面幾微米的地方，在一定的時(shí)間里就會(huì)對該細(xì)胞施予定量的藥物。 ?此法和微電極記錄法結(jié)合起來，在研究諸如化學(xué)遞質(zhì)和各種物質(zhì)的作用方面是非常有效的。 如 1：肌纖維對乙酰膽堿的感受性只局限于終板部位，用此法能檢查出僅僅離開終板 5微米地方對乙酰膽堿的感受性降到 1／ 10以下。 如 2：做中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)是不能直接觀察的，所以通常都是把記錄電極和吸量管連結(jié)起來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在運(yùn)用這種方法的過程中，還可以把 2~5個(gè)藥液吸量管連結(jié)起來，研究 2~5種藥物對同一細(xì)胞的效應(yīng)。 差異凝膠電泳 ? 將樣品在電泳前標(biāo)記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料 ,然后將標(biāo)記后的 3 種樣品混合 , 同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳 ,即為差異凝膠電泳 (DIGE) 。 ? 所得到的 2D 膠圖像可使用 3 種不同的激發(fā) P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號 ,根據(jù)這些信號的比例來判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異 ,這樣可避免在匹配時(shí)出現(xiàn)的誤差 ,進(jìn)行定量分析時(shí)也不依賴于膠與膠之間的重復(fù)性。 ? 用于標(biāo)記的熒光基團(tuán)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似 ,分子量也基本相同 ,都帶有正電荷 ,所以在與賴氨酸殘基反應(yīng)時(shí) ,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。 第六節(jié) 電泳測純技術(shù) ?農(nóng)作物種子品種純度是種子質(zhì)量評價(jià)的主要指標(biāo)之一，為了解決農(nóng)作物種子純度和品種真實(shí)性鑒定問題，近年來大量電泳測純技術(shù)應(yīng)用在農(nóng)作物種子品種純度鑒定中。 ?種子電泳技術(shù)是通過蛋白質(zhì)或同工酶的分子大小和電荷數(shù)量或兩項(xiàng)同時(shí)具有的差異進(jìn)行分離，并形成不同電泳圖譜而顯示種和品種之間差異的有效方法。 ?醇溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酸溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、鹽溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酯酶同工酶電泳技術(shù)等技術(shù)先后出現(xiàn)，并應(yīng)用于水稻、玉米、蔬菜、雜交油菜種子純度鑒定試驗(yàn)，均有成功的報(bào)導(dǎo)。 ?等電聚焦電泳技術(shù)出現(xiàn)后，因其譜帶清晰、分辨率高而備受歡迎，但由于其成本高、時(shí)間長、技術(shù)難度大，難以推廣等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了它在種子測純中的應(yīng)用。 ?為了進(jìn)一步推動(dòng)電泳技術(shù)在種子純度鑒定中的推廣應(yīng)用，國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ ISTA）品種技術(shù)委員會(huì)于 1983年成立生化測定工作組，致力于總結(jié)和發(fā)展種子測純電泳技術(shù)。 ?1986年 ISTA正式頒布了“醇溶蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）鑒定品種的程序”并列入 《 1993國際種子檢驗(yàn)規(guī)程 》 ，我國也將其納入 GB/T35431995《 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 》 。 ?1998年全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心組織北京、山西、吉林等 12家種子檢驗(yàn)單位成立項(xiàng)目組，在對現(xiàn)行的各種電泳純度鑒定方法進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，選定鹽溶蛋白電泳、醋酸尿素蛋白電泳和酯酶同工酶電泳三種電泳方法進(jìn)行攻關(guān)研究，最終于2022年 11月出臺了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T449— 2022《 玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法 》 。 ?農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心 (太原 )作為全國玉米種子電泳測純技術(shù)項(xiàng)目協(xié)作攻關(guān)單位之一，已廣泛開展了玉米、小麥種子純度電泳檢測工作，年檢測樣品量約 300份，為政府和企業(yè)決策提供了充分的依據(jù)。 ?目前主要應(yīng)用于農(nóng)作物品種純度鑒定的電泳方法有四種：蛋白質(zhì) PAGE（小麥、大麥、玉米、大豆、水稻等）、 SDS PAGE（玉米、西瓜等）、等電聚焦電泳（玉米、菜豆、水稻、大豆、蔬菜等）和淀粉凝膠電泳（玉米等）。