【正文】 b在波長 645nm有吸收蜂。 ?式中 Ca、 Cb分別為葉綠素 a及葉綠素 b的濃度，為了便于區(qū)別用 d代表光徑。 ?當(dāng) d=， C取 mg/mL為單位時，其 ε值已由實(shí)驗(yàn)測定，分別為： εa1= εb1= εa2= εb2= 葉綠素提取液的消光度在兩種波長下分別為 A1及A2，它們可寫為： ?可得到每克葉片中所含葉綠素的毫克數(shù) : ?W為葉片的鮮重、單位為克． V是 80％丙酮 葉綠素提取液的最終體積，單位為毫升．測量時以 80％丙酮為空白對照，比色池的光徑為 10mm。 ?另外，葉綠素 a、 b的等吸收點(diǎn)在 652nm，故可在652nm測定。 酶動力學(xué)研究 ?分光光度法是酶動力學(xué)研究最有效的工具。 ?通過酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究，有助于了解酶與底物的結(jié)合機(jī)制和作用方式、酶的底物濃度與蔭促反應(yīng)速度的關(guān)系符合米氏理論。 第五節(jié) 原子吸收分光光度法 ?1802年，發(fā)現(xiàn)原子吸收現(xiàn)象：原子蒸氣對其原子共振輻射吸收的現(xiàn)象； ?1955年，澳大利亞物理學(xué)家 Walsh A（瓦爾西）發(fā)表了著名論文： 《 原子吸收光譜法在分析化學(xué)中的應(yīng)用 》 ，奠定了原子吸收光譜法的基礎(chǔ)，之后迅速發(fā)展。 ?原子吸收光譜法特點(diǎn)： (1) 檢出限低， 1010～ 1014 g； (2) 準(zhǔn)確度高，誤差在 1%～ 5%； (3) 選擇性高，一般情況下共存元素不干擾； (4) 應(yīng)用廣，可測定各種樣品中 70多個元素。 ?原子吸收光譜法 局限性： (1)難熔元素、非金屬元素測定困難 (2)不能同時多元素 第六節(jié) 熒光分析法 ?某些物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后，能立即放出能量較低（亦即波長較長）的光。 ?當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在 109秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光 ?超過此限度即稱為磷光。 ?熒光的波長與被照射物質(zhì)有關(guān)。以紫外線作激發(fā)光源，所發(fā)射的熒光常在可見光區(qū)。 ?測量熒光強(qiáng)度以確定物質(zhì)含量的方法叫做熒光分析法，所使用的儀器叫熒光計(jì)。 原理 ? 設(shè) IF為熒光強(qiáng)度； ? I0入射紫外線強(qiáng)度； ? It為透過溶液后紫外線強(qiáng)度； ? Ia為溶液吸收紫外線； 則： Ia=I0It ? C為溶液中被測物質(zhì)的濃度； ? l為溶液層的厚度。 據(jù)朗伯 比爾定律 A =εlc cltII ?100 ?? ? ? ?clclcla IIIII ???? 110110 ??? ???????? ?? ?? ? clIclIIclacl?????00?????????t0lg1lgIITA ??經(jīng)數(shù)學(xué)推導(dǎo) ， 當(dāng)濃度很小時： 又 Ia=I0It ，則 熒光強(qiáng)度 IF與物質(zhì)吸收紫外線的強(qiáng)度成正比 clKIKII aF ???當(dāng)紫外線的強(qiáng)度一定，溶液的厚度一定，對同一物質(zhì)而言 KI0εl為常數(shù)，以 A表示，故 : IF=AC 這說明濃度與熒光強(qiáng)度成正比，這就是熒光定量分析的理論基礎(chǔ)。 只要測出樣品溶液的熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，就可按正比關(guān)系計(jì)算樣品溶液的濃度。 CX為樣品溶液濃度 CS為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 IFX為樣品溶液熒光強(qiáng)度 IFS為標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度 SFFX CIICSX ?? 熒光計(jì) ?熒光分析中有兩種光線：紫外線和熒光。 ?在比色計(jì)中光源、比色杯和光電源三者排列成一條直線。 ?在熒光計(jì)中三者需排成三角形，通常呈直角三角形，如圖。 比色計(jì)與熒光計(jì)兩種裝置不同點(diǎn)之二 ?比色計(jì)中光源是普通的鎢絲燈。 ?熒光計(jì)中的光源則必須是產(chǎn)生紫外線的汞燈，常用的是高壓汞燈，發(fā)射的是線狀光譜；能透過汞燈玻璃套管的主要射線波長是 365nm。 比色計(jì)與熒光計(jì)兩種裝置不同點(diǎn)之三 ?比色計(jì)中只有一種光源，只需要一個濾光板 ?熒光計(jì)中有兩種輻射、三個濾光板 : ?濾光板 1用于過濾紫外線，除去其中可見光 ?濾光板 2用于過濾熒光，以去除其他顏色的雜光； ?濾光板 3可濾去熒光中夾雜的紫外線 熒光分析的操作 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 ? 先配制一第列濃度由大到小的標(biāo)準(zhǔn)管 C1，C C … … ， C1為濃度最大的標(biāo)準(zhǔn)管 作為起始濃度，置熒光計(jì)透光率為 100，調(diào)節(jié)光柵使檢流計(jì)指零。 ? 然后再測一系列濃度較低的標(biāo)準(zhǔn)管的透光率，以濃度對透光率作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的另一作法是以空白溶液為起始濃度，置熒光計(jì)透光率于 10或 20處，調(diào)節(jié)光柵使檢流計(jì)指零。 ?然后再測一系列濃度較高的標(biāo)準(zhǔn)管的透光率，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 比較法 ? 先配一標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度應(yīng)略大于樣品溶液，濃度越接近，誤差越小。 ? 以此標(biāo)準(zhǔn)溶液為準(zhǔn)，調(diào)節(jié)透光率在 20~60之間的某一數(shù)值上。 ? 然后測定樣品溶液及空白溶液的透光率。 ? 由下式求得 : C標(biāo)準(zhǔn) 透光率為 60； C樣品 的透光率為 X； 空白溶液的透光率為 Y 標(biāo)準(zhǔn)樣品 CYYXC ????60 熒光分析的注意事項(xiàng) 熒光的減退 ? 熒光物質(zhì)經(jīng)紫外線長時間照射及空氣的氧化作用，會使熒光逐漸減退 . 試劑的濃度 ? 有些試劑能吸收紫外線，有顏色的試劑還有吸收熒光的作用，因此分析時所加試劑的量不可太多 。 pH的影響 ?大多數(shù)熒光反應(yīng)都受溶液酸堿度的影響，故熒光分析需在適合的酸堿度溶液中進(jìn)行。 ?最適當(dāng)?shù)乃釅A度必須由實(shí)驗(yàn)來確定。 ?所用酸的種類也影響熒光的強(qiáng)度，例如，奎寧在硫酸溶液中的熒光較在鹽酸中的要強(qiáng)些。 溶劑 ? 許多有機(jī)物及金屬的有機(jī)絡(luò)合物，在乙醇溶液中的熒光比在水溶液中強(qiáng)。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的溶劑。 ? 熒光分析所用的有機(jī)試劑，在有機(jī)溶劑中大多有熒光，應(yīng)設(shè)法避免；一般避免的辦法是稀釋，或加入一部分水。 鹽類的影響 ? 能與試劑發(fā)生反應(yīng)的其他金屬鹽類都應(yīng)事先除去。 ? 堿金屬與銨鹽雖不參與反應(yīng)，但量太大亦有妨礙。 ? 強(qiáng)氧化劑、還原劑及絡(luò)合劑均不應(yīng)存在于溶液中。 熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值的時間不同 ?有的反應(yīng)加入試劑后立即達(dá)到最高峰。 ?有的反應(yīng)需要經(jīng)過 15~30min達(dá)到最高峰。 其他影響 ?有機(jī)溶劑中常有產(chǎn)生熒光的雜質(zhì)，可用蒸餾法提純。 ?橡皮塞、軟木塞及濾紙中也常有能溶于溶劑的一些帶熒光的物質(zhì)。 熒光分析法優(yōu)點(diǎn)小結(jié) ?靈敏度高 ?儀器設(shè)備相對簡單，休積小 ?操作較簡便 ?反應(yīng)時間也較快 第七節(jié) 散射光譜分析法 光線通過溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類定量方法。