核酸分子雜交ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 01:09本頁面
【正文】 符號 半衰期 β射線能量（ MeV） 氫 3 3H 碳 14 14C 5720年 磷－ 32 32P 硫－ 35 35S 碘－ 131 131I 常用同位素的特征 非放射性標(biāo)記 優(yōu)點：無環(huán)境污染，可較長時間貯存 方法： 要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對組織細(xì)胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響 DNA三維空間構(gòu)象的形成。 常用的標(biāo)記物：生物素（ biotin）、地高辛（ digoxigenin）、光生物素（ photobiotin）、補(bǔ)骨脂素、2乙酰氨基芴（ 2acetylomino fluorene） 地高辛（ Digoxigenin 簡寫 Digo）又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應(yīng)，地高辛配基標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（ dUTP）上形成 digoxigenin –11dUTP 地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇（ Steroid）物質(zhì) —— Digoxigenin （ DIG），在醫(yī)學(xué)上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上性心動過速、心房顫動和撲動等疾病。由于洋地黃植物的花和葉片 Digoxigenin在自然界中的唯一來源，因此抗 DIG的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要。這一點，正是 DIG勝于生物素 (Biotin)的地方 ——同樣是小分子標(biāo)記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對于靈敏度很高的標(biāo)記檢測實驗來說，樣品自身含有的內(nèi)源生物素，就會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個問題 。 通過隨機(jī)引物或缺口翻譯法（多用隨機(jī)引物法），將 dig11dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成 Dig配基標(biāo)記的核酸探針。將這種標(biāo)記的探針與核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補(bǔ)雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體 Tab（抗原結(jié)合片段）結(jié)合物作為酶標(biāo)或熒光標(biāo)記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達(dá)到檢測目的。 對于 DIG 標(biāo)記探針的雜交檢測，可選用連接有堿性磷酸酶（ alkaline phosphatase），過氧化物酶(peroxidase),熒光素（ fluorescein） ,若丹明（ rhodamine）或是膠體金（ colloidal gold）高親和性的抗 DIG抗體共軛物；也可選用不帶任何共軛連接的抗 DIG抗體和二級抗體。 DIG 系統(tǒng)的優(yōu)勢： （ 1）高靈敏度，完全可滿足實驗需要，某些方面甚至可與放射性標(biāo)記的靈敏度向媲美 （ 2）曝光時間短，結(jié)果顯示時間以分鐘計算，無需幾小時甚至幾天的自顯影過程 （ 3）安全環(huán)保，不接觸放射性物質(zhì)，不會對環(huán)境造成污染 （ 4）探針可重復(fù)使用，最少可以穩(wěn)定儲存一年 （ 5）可輕松進(jìn)行探針撥離和重探 檢測的靈敏度主要依賴于對不同抗 DIG抗體共軛物顯示方法的選擇。以連接有堿性磷酸酶的抗DIG 抗體為例：即可以使用 NBT或 BCIP做底物的顯色法，也可以使用 HNPP熒光堿性磷酸酶底物，檢測的靈敏度常規(guī)可達(dá)到 常用的免疫酶學(xué)檢測方法有兩類：一是 Dig –HRP（辣根過氧化物酶）檢測體系，以 DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺） /H2O2為底物，結(jié)果為棕色；或以 4氯 1萘酚 /H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。另一是 Dig –AKP檢測體系：以 BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。與免疫細(xì)胞化學(xué)方法相似，如應(yīng)用酶促反應(yīng)會較單一信號的標(biāo)記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學(xué)反應(yīng)， AKP靈敏度和分辨率較 HRP高約 10倍左右，但 HRP的優(yōu)點為價廉、穩(wěn)定。 DIG標(biāo)記的 dUTP代替部分 dTTP摻入待標(biāo)探針中，經(jīng)雜交后用與堿性磷酸酶 Ap（ alkaline phosphatase）連接的 DIG抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，通過 Ap使反應(yīng)底物CSPD脫磷，脫磷后的產(chǎn)物不穩(wěn)定，繼續(xù)分解同時釋放出光子，可用 X光片顯示雜交信號。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1