核酸結(jié)構(gòu)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-04 02:58本頁(yè)面
【正文】 。（一）密度梯度超速離心測(cè)定核酸的浮力密度：8MCsCl， 45000rpm， 16h密度梯度： →平衡時(shí)：浮力密度 =CsCl密度 =離心力ρ=ρ0+（ r2r02） 1010ρ： 浮力密度ω： 角速度（弧度 /秒）r： 樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（二）密度梯度超速離心測(cè)定 DNA的 GC含量GC含量與 DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系ρ=xGC+xGC=（ ） 10但是 5甲基胞嘧啶多的 DNA， 其實(shí)際浮力密度會(huì)降低，低于理論值。（ 三）密度梯度超速離心研究核酸的構(gòu)象RNA＞ DNA變性 DNA＞ 雙鏈 DNA＞ 蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（ 四）密度梯度超速離心純化 RNA或不同構(gòu)象的 DNA超螺旋 DNA或三、 核酸的凝膠電泳（一）、 瓊脂糖電泳用于大片段 DNA的分離，精度低，但分離范圍廣★ 影響遷移率的因素：① 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比② 凝膠濃度③ DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線(xiàn)形其次，環(huán)形最慢。④ 電壓，不大于 5V/cm★ 染色： EB★ RNA的瓊脂糖凝膠電泳一般要加入甲醛或戊二醛★ 瓊脂糖電泳可以用于DNA分子量的測(cè)定★ 瓊脂糖電泳可以用于 DNA的制備與純化（ 二）、 PAGE電泳用于小片段 DNA的分析，精度非常高四、限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA物理圖譜構(gòu)建（ 1979年發(fā)現(xiàn)）(一 )、 限制修飾系統(tǒng)限制性?xún)?nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時(shí)成對(duì)存在，構(gòu)成一個(gè)限制修飾系統(tǒng)，甲基化酶使細(xì)菌自身的DNA帶上標(biāo)志，限制性?xún)?nèi)切酶專(zhuān)門(mén)用于降解入侵的外源 DNA(二 )、 II型限制性核酸內(nèi)切酶限制和修飾活性分開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子 Mg2+， 位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)（反向重復(fù)）?！?II型酶的切割頻率識(shí)別位點(diǎn) 444=256646=4096848=65536★ 限制酶的命名： 第一位： 屬名 E（ 大寫(xiě)）第二、三位：種名的頭兩個(gè)字母小寫(xiě) co第四位： 菌株 R第五位： 從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類(lèi)酶的編號(hào)★ 同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱(chēng)自然不同），識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。BamHI： GG↓ATCCBstIGG↓ATCCMboIGAT↓CSau3AGAT↓C★ 同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BclITG↓ATCABglIIAG↓ATCA★ 星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性 pH，或 50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類(lèi)會(huì)發(fā)生變化。例如 HindIIIAAG↓CTT(三 )、 DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、 DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種 DNA時(shí)，弄清該 DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此 DNA的基礎(chǔ)。★ 末端標(biāo)記法構(gòu)建 DNA物理圖譜：（ 1）單酶完全降解和部分降解（ 2）雙酶降解五、 DNA序列分析（一） 雙脫氧終止法英國(guó) Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu)， 1958獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1975設(shè)計(jì)出 DNA測(cè)序法， 1980獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)合成一段與待測(cè) DNA序列互補(bǔ)的 DNA片段群。MOV:\DideoxysequencingofDNADNA序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP（二） 化學(xué)裂解法 MaxamGilbert ， 1977原理：利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群經(jīng)側(cè)序膠電泳和放射自顯影得到側(cè)序圖譜。32PGCTACGTA：在 A處： 32PGCT和 32PGCTACGT在 G處： 32p， 32pGCTAC在 C處： 32PG和 32PGCTA在 T處： 32PGC和 32PGCTACGG反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸 /哌啶C反應(yīng)：肼 /NaCl/哌啶C+T： 肼 /哌啶哌啶：促使修飾化堿基脫落，并使脫堿基的磷酸二酯鍵斷裂硫酸二甲酯（ G）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（ G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼 /Nacl（ C）： *AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG肼（ C+T）： *AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀： CTACGTA， 末端 G不能讀出。32P*ACTTCGACAG（三） RNA的側(cè)序（ 1）酶裂解法 胰 RNaseA： 嘧啶結(jié)尾米曲霉 RNaseT1： 鳥(niǎo)苷酸結(jié)尾黑粉菌 RNaseU2： 腺苷酸結(jié)尾多頭黏菌 RNasePhyI： A、 G、 U結(jié)尾（ 2）化學(xué)裂解法（ 3）逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA法六、 DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) —— PCR① 模板 DNA（ 單鏈）② 引物③ DNA聚合酶（ Taq）④ dNTP⑤ Mg2+MOV:\POLYMERASECHAINREACTION七 、 DNA的化學(xué)合成：P521圖 156固相合成法（亞磷酸三酯法） 合成 DNA合成方向： 3’→5’ 端5’OH用二對(duì)甲氧三苯甲基（ DMT） 保護(hù)。3’OH用氨基亞磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護(hù)
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