生物大分子分離純化技術(shù)-資料下載頁
2025-01-16 17:04本頁面
【正文】 與羥基磷灰石的相互作用基于 DNA磷酸酯骨架與羥基磷灰石中的鈣離子間的相互作用 。 洗脫時用磷酸緩沖液 ， 核酸分子的親和性受其分子中磷酸基團的控制 。 單鏈 DNA分子的結(jié)構(gòu)可變無序 ， 它與剛性有序的雙鏈 DNA分子相比 ， 其親和性要小 。 雜交的雙鏈 DNA及部分變性的 DNA分子的親和性適中 。 因此 ， 單鏈 DNA分子的結(jié)合弱 ， 結(jié)合的雙鏈 DNA分子可以通過增加磷酸洗脫緩沖液的濃度使之解離 。 37 3 離子交換色譜 離子交換色譜 (Ion Exchange Chromatography, IEC)是生物大分子分級分離的最可靠的方法之一 ， 它分離蛋白質(zhì) 、 核酸等是依據(jù)生物大分子的電荷特性 ， 因而依賴于系統(tǒng)的 pH及分離物質(zhì)的等電點 (pI)。 當緩沖溶液的 pH高于生物分子的 pI時 ， 應(yīng)采用陰離子交換樹脂 ， 反之 ， 應(yīng)采用陽離子交換樹脂 。 生物大分子非常小的電荷差異都可以用 IEC法分離開 。 38 4 反相疏水作用色譜法 反相色譜 (Reversephase Chromatography, RPC)及 疏 水 作 用 色 譜 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)法依據(jù)的是生物大分子表面疏水性 。 反相色譜是基于溶質(zhì) 、 極性流動相和非極性固定相表面之間的疏水作用建立的一種色譜模式 。 而疏水作用色譜與反相色譜的原理相同 ， 只是填料表面疏水性弱一些 。 39 蛋白質(zhì)及多肽的疏水基因一般包埋在分子的內(nèi)部 ． 許多生物大分子盡管是親水性的 ， 但它們也有足夠多的疏水基團暴露在分子的表面 ， 因而可以與載體表面的疏水基團發(fā)生相互作用 。 在上述兩種技術(shù)中固定相都由具有疏水表面的色譜基質(zhì)所組成 ， 但與反相色譜相比 ， 疏水作用色譜載體表而的疏水基團的密度要低得多 ， 因而它的選擇性高 ， 洗脫強度相應(yīng)低 ， 有利于生物大分子的洗脫及生物活性的保持 。 高鹽濃度可增強生物分子與載體的疏水相互作用 . 反相色譜法常作為一種制備色譜用于核酸相關(guān)的研究 。 40 5. 液－液分配色譜 在液 — 液分配色譜中 ， 流動相和固定相均為液體 ， 分離基于 DNA分子在兩種液相間的分配差異 ，但液體固定相是通過物理吸附或化學(xué)鍵合的方式固定在支持載體的表面上的 。 41 常見的液 — 液分配色譜中含有兩種液體 ， 如水合聚乙烯醇 (PEG)和葡聚糖 (DX)。 PEG和 DX之間由于缺乏相互作用而成為完全分離的兩相 ， DX可以通過共價鍵鍵合固定在固相載體的表面而作為固定相 。因此 ， DNA在兩相間的分配系數(shù)主要依賴于溶質(zhì)的表面積 ， 即 DNA分子的分子質(zhì)量 ， 但兩相中所存在的離子的濃度及其性質(zhì)會對 DNA的分配產(chǎn)生極大的影響 。 當鹽的濃度大于 mol/L時 ， 核酸在 DX中的溶解度遠遠高于在 PEG中的溶解度 。 這是由于陰離子和陽離子在兩相間的不等價分配造成的 。
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