核酸分離和純化ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-01 01:09本頁(yè)面
【正文】 DNA的方法都包括 3個(gè)基本步驟： 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒 DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒 DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需 )。 選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。 44 質(zhì)粒提取原理 45 質(zhì)粒 DNA的純化與回收 ? 純化 ? CsClEB法 ? 聚乙二醇沉淀法 ? 柱層析法 ? 回收：與基因組 DNA類似 46 RNA的分離和純化 ? RNA易被 RNase水解 ， RNase除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚 、 唾液 、 汗液及周圍的環(huán)境中 ? RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定 ? 排除 RNase的污染是 RNA制備成功與否的關(guān)鍵 47 RNA制備的條件與環(huán)境 ? 潔凈的實(shí)驗(yàn)室 ? 操作人員帶口罩，勤換手套 ? 玻璃器皿（如勻漿器）、鑷子 180℃ 干烤 8 h或更長(zhǎng)時(shí)間 ? 槍頭、 EP管 %DEPC水浸泡過(guò)夜，再高壓；或直接購(gòu)買無(wú) RNase的槍頭和 EP管 ? 冰上勻漿， 4 ℃ 離心 48 ? Trizol的主要成分是 苯酚 。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制 RNA酶活性。 ? Trizol中還加入了 8－羥基喹啉、 異硫氰酸胍 、β巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源 RNase（ RNA酶）。 Trizol法提取總 RNA 49 Trizol法提取總 RNA步驟 Chloroform 首選 Invitrogen 50 Trizol法提取 RNA步驟 每 50100mg 組織加入 1ml Trizol ，用勻漿器勻漿處理 ，室溫放置 5min，使其充分裂解。 12,000rpm 離心 5min，棄沉淀。 加入氯仿 200微升每管，劇烈振蕩 15s ，室溫放置 23 min 。 12022g ,4℃ ，離心 15 min 吸取上層水相 (約 400微升），至另一離心管中。注：千萬(wàn)不要吸取中間界面；若同時(shí)提取 DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于 4℃ 冰箱 ,若只提 RNA，則棄下層酚相。 每使用 1ml Trizol 加入 ml 異丙醇，室溫 10min 。 12022g ， 4℃ ， 10 min ,棄上清， RNA沉于管底。 加入 1 mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。 12022g ,4℃ ,5min 。，盡量棄上清。 室溫晾干或真空干燥 510min。加入 20微升無(wú) RNase 水溶解 RNA 沉淀。 51 除血紅蛋白及某些組蛋白外，絕大多數(shù) mRNA在其 3‘ 末端帶有 1個(gè)長(zhǎng)短不一的多聚核苷酸的結(jié)構(gòu)，即poly（ A）尾巴 ? olig（ dT） 纖維素柱層析法 ? olig（ dT） 纖維素液相結(jié)合離心法 ? 其他方法：磁珠法 生物素標(biāo)記的 oligo（ dT）結(jié)合 poly（ A）尾，再結(jié)合親和素標(biāo)記的磁珠 mRNA的分離和純化
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