【正文】 DNA技術(shù)。 廣泛應(yīng)用于酶制劑、食品添加劑、抗生素、維生素、氨基酸和各種藥物的生產(chǎn)。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 基因工程操作 ? ① 目的基因分離； ? ② 載體分離； ? ③限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用； ? ④基因重組； ? ⑤細胞轉(zhuǎn)化和基因表達。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 如： Palav等人采用 PVB10載體，將液化淀粉 芽孢桿菌（ ）的 α淀粉酶 基因克隆到 枯草桿菌 中，獲得抗卡那霉素轉(zhuǎn)化株，其淀粉酶活力比野生型原始菌株高 500倍。 ? 20世紀 80年代，將制造干酪的凝乳酶是把小牛胃中的凝乳酶基因克隆至細菌或真菌中進行表達，此技術(shù)在 20實際 80年代初就已成功。 1990年美國 FDA批準(zhǔn)該凝乳酶上市，為世界干酪生產(chǎn)解決了酶源問題。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 生產(chǎn)面包的酵母（ Saccharomycescerevisiae）也是采用基因克隆技術(shù)改造的。其方法：把具有優(yōu)良特性的酶基因克隆至該酵母中，從而使該酵母含有的 麥芽糖透性酶 和 麥芽糖酶 的活力比原始面包酵母高，是面包加工中產(chǎn)生的氣體增加，面包發(fā)酵膨發(fā)性增加，成品特別松軟可口，也可延長產(chǎn)品的貨架期。 ? 基因工程應(yīng)用于改良產(chǎn)酶菌株性能已較為普遍，其他方法（如細胞融合技術(shù)等）也得到應(yīng)用。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 D. 其他提高酶產(chǎn)量的方法 添加產(chǎn)酶促進劑 促進劑 對發(fā)酵起一定促進作用的物質(zhì)， 既不屬于營養(yǎng)物質(zhì)又不是前體， 但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 促進劑 ? 有些促進劑本身是酶的 誘導(dǎo)物； ? 有些促進劑是 表面活性劑， 可改善細胞的透性， 改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)； ? 有些促進劑的作用是 沉淀或螯合有害的重金屬離子。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 三、食品用酶發(fā)酵生產(chǎn)舉例 ? 淀粉酶 √ ? 糖化酶 √ ? 蛋白酶（ 酸性 √ 、 中性、堿性） ? 脂肪酶 ? 果膠酶 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 三、食品用酶發(fā)酵生產(chǎn)舉例 ? 淀粉酶分為四大類 p22： ? ? ? ? （異淀粉酶） ? 此外： ? 環(huán)化糊精生產(chǎn)酶 ? C C6生成酶 ? α葡萄糖苷酶（葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶） 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 三、食品用酶發(fā)酵生產(chǎn)舉例 ? α淀粉酶 ? 中國淀粉糖工業(yè)使用的液化酶 BF765美國的 Tenase等都屬于枯草桿菌。 ? 地衣芽孢桿菌 ATCC9789，用 γ射線、亞硝基胍（ NTG）、紫外線單獨或交叉處理 7次后，用其生產(chǎn)耐熱性 α淀粉酶活性增加 25倍，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。 ? 枯草桿菌 BF7658所產(chǎn)的淀粉酶是中國產(chǎn)量最大、用于最廣的一種液化型 α淀粉酶。經(jīng)多次誘變，酶活提高 50%。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 1. α淀粉酶的生產(chǎn) ? 枯草桿菌 BF7658培養(yǎng)工藝條件： ? 培養(yǎng)基： 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 1. α淀粉酶的生產(chǎn) 工藝條件 ? 發(fā)酵罐： 3000L；標(biāo)準(zhǔn)冷卻夾套；二檔圓盤彎葉渦輪；三塊擋板： ? T： 37℃ ? PH ： ? r ： 300r/min ? P ： ~(1atm=101325Pa） ? 通風(fēng)量： 0~10h:。10~14h:? 補料：基礎(chǔ)料與補料體積比： 3:1； 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 1. α淀粉酶的生產(chǎn) ? 為了利于菌體生長產(chǎn)酶，避免原料中淀粉降解生成的糖過量積累而引起分解代謝阻遏，采用 低濃度發(fā)酵高濃度補料。 ? 補料 中豆餅粉、玉米粉的含量高達 30%，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 。 ? 提?。?鹽析、有機溶劑沉淀、淀粉吸附三種方法。 ? 最常用的是用硫酸銨鹽析。硫酸銨溶解度較大。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 2. 糖化 酶的生產(chǎn) ? 1）菌種： 主要為根霉、曲霉。 ? 2）糖化酶工藝 ? 斜面培養(yǎng)基：察氏瓊脂培養(yǎng)基，麩皮， 31℃ ，取孢子。 ? 種子培養(yǎng)：玉米粉 4%，豆餅粉 3%，麩皮 1%等。自然 pH。 ? 發(fā)酵培養(yǎng)：玉米粉 10%，豆餅粉 3%，麩皮 1%等。 ? T： 30~32℃ ? PH ： ? r ： 180r/min ? P ： ? 通風(fēng)比： 0~12h: 。12~24h: 。 24~84h:1VVm。 84h后 : 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 2. 糖化 酶的生產(chǎn) ? 有關(guān) pH的控制 ? 隨著黑曲霉的生長， pH逐步下降。 16~40h原料淀粉均轉(zhuǎn)化成還原糖并逐漸形成檸檬酸使 pH下降。 ? 當(dāng) pH低于 3時，菌體生長緩慢。 ? 當(dāng) pH高于 5時，菌體易自溶。 ? 控制 pH在 （左右），也是原料糖化的適宜條件，即使得原料充分糖化，又有利于菌體繁殖。 ? 酶活性比沒有 pH控制的增加 %。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 2. 糖化 酶的生產(chǎn) ? 有關(guān)補料的控制 ? 為了提高溶氧，可提高攪拌速度和加大通風(fēng)量，但在實際生產(chǎn)中不易改變。中間補料的方法可間接提高溶氧。 ? 實際操作：基礎(chǔ)料與補料總體積比 3:1，豆餅粉和玉米粉基礎(chǔ)料與補料比為 5:1。接種后 16~48h之間，視發(fā)酵液中 pH和菌體生長情況進行 2~3次補料。 ? 由于補料操作，使通風(fēng)量相對增大。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 蛋白酶分類 ? 工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶，主要是內(nèi)肽酶。 按降解方式 按作用的最適 pH 按其活性中心 端肽酶 內(nèi)肽酶 酸性蛋白酶 堿性蛋白酶 中性蛋白酶 絲氨酸蛋白酶 金屬蛋白酶 巰基蛋白酶 天冬氨酸蛋白酶 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 蛋白酶 ? 酸性蛋白酶 的最適 PH從 2左右 (胃蛋白酶 )到 4左右 .從酶的活力 PH曲線分析 ,在酶的活性部位中含有一個或更多的羧基 .這一類蛋白酶中研究最徹底的是胃蛋白酶 . ? 堿性蛋白酶 是由選育的地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得，主要成分為枯草桿菌蛋白酶，是一種內(nèi)切酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為 27300。 ? 堿性蛋白酶外觀為褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，適宜于在 4055℃ 、 PH911的堿性條件下使用，超出以上范圍酶的活力下降。重金屬離子和陽離子表面活性劑對其活力有抑制作用， ? 中性蛋白酶 水解溫度 35 ～ 55 ℃ PH 值： ～ 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 酸性蛋白酶生產(chǎn)菌種以曲霉為主，另有青霉、毛霉等 ? 酸性蛋白酶是生產(chǎn)歷史較長，工藝比較成熟并為較典型的一種蛋白酶。 ? 酸性蛋白酶可用作消化劑、消炎劑、 啤酒澄清 劑，也可供毛皮軟化工業(yè)等應(yīng)用。 ? 黑曲霉 AS 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 茄子瓶斜面菌種 ↓ 種子罐 ↓ 發(fā)酵罐 ↓ 鹽析 ← 55%(NH4)2SO4 ↓ 濾袋壓榨 → 硫酸銨廢液作農(nóng)肥 ↓ 裝盤 ↓ 烘干 ↓ 磨粉 ↓ 包裝 ? AS 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 發(fā)酵工藝 ? 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 豆餅粉 ％、玉米粉 ％、魚粉 ％、 NH4C1 1％、 CaC12 ％、％，豆餅粉或蠶蛹粉水解液 10％，初始 pH ， ? 發(fā)酵溫度均為為 31177。 1℃ ， ? 種子罐通氣量為 1:， ? 培養(yǎng)時間為 26h。 ? 發(fā)酵通氣量 ? 0～ 24h 1:、 ? 24h～ 48h 1:、 ? 48h～發(fā)酵結(jié)束 1:， ? 發(fā)酵周期 72h， ? 酶活性一般可達 2500一 3200u/mL。 ? 豆餅粉或蠶蛹粉水解液制備，取豆餅粉或蠶蛹粉 100份、石灰 6份和水 600份，在 104Pa表壓下，加熱水解 1h。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 提取 ? 培養(yǎng)物濾去菌體，鹽酸調(diào) pH至 ，加硫酸銨使?jié)舛冗_ 55％，靜置過夜，傾去上清，將沉淀通過壓濾除去母液，于 40℃ 干燥 24h，烘干后進行磨粉與包裝，即可得工業(yè)用粗酶制品。鹽析收率在 94%以上，干燥后總收率在 60％以上，每克酶活力為 20萬單位左右。 ? 在發(fā)酵液濾去菌體后用薄膜蒸發(fā)器于 40℃ 濃縮 34倍，直接作為液體酶制劑。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 ? 精制 ? 作為醫(yī)用或啤酒工業(yè)用酶，則需進一步精制 ? 壓濾所得的酶泥溶于 mo1/L乳酸緩沖液中，用脫色樹脂脫色 (收率 93％ )，用真空薄膜蒸發(fā)器于 40℃ 濃縮 2倍以上（收率 90%） ? 離子交換樹脂（ 73 701樹脂混合床）脫鹽（收率 90%）、噴霧干燥或冷凍干燥、磨粉，可得淡黃色乃至乳白色的粉狀酶制品，酶活性為每克 4060萬單位。 ? 丹寧沉淀法取也可得到具有同樣酶活性的制品。