醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-01-04 04:55本頁(yè)面
【正文】 孢菌素 C 74 DAOCS 純化策略 純化目標(biāo) DAOCS定性 準(zhǔn)備樣品 精細(xì)純化 粗提 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 中度純化 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 75 DAOCS 純化 目標(biāo) ? 得到 510 mg DAOCS， 純度足夠進(jìn)行結(jié)晶和 X射線繞射分析 ? 在一個(gè)工作天內(nèi)完成整個(gè)純化流程 ? 工藝可放大最少 10 倍 . 76 結(jié)晶純需要 ? 大分子均一性 其他 , 污染性蛋白質(zhì) ? 序列均一性 蛋白水解片段 轉(zhuǎn)譯后修飾 其他修飾 (氧化等 ) ? 構(gòu)象均一性 聚合 失活 要拿到高純度結(jié)晶， 必須 使用純和均勻的蛋白質(zhì) 77 DAOCS 定性 參數(shù) 等電點(diǎn) 分子量 鹽穩(wěn)定性 一般穩(wěn)定性 對(duì)純化設(shè)計(jì)的影響 在粗提時(shí)使用中性 pH 進(jìn)行陰離子交換層析 用 Superdex? 75 prep grade 凝膠過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行精細(xì)純化 可以使用疏水層析 在緩沖液中加 DTT 工藝設(shè)計(jì)重點(diǎn) 縮短整體純化時(shí)間 數(shù)值 34 500 2 M (NH4)2SO4 容易氧化 78 DAOCS 一般準(zhǔn)則 ? 在所有緩沖液中加 DTT 使所有半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài) ? 加入蛋白酶抑制劑以保持生物活性 ? 用 SDS PAGE 檢查每一個(gè)組份中 DAOCS ? 利用酶測(cè)定法測(cè)量生物活性 79 準(zhǔn)備樣品 懸浮細(xì)菌細(xì)胞在溶解緩沖液中 超聲震蕩破碎細(xì)胞 DNA 沉淀 利用離心沉淀 來(lái)源 :從 S. Clavuligerus 克隆得到的 DAOCS 基因 和在大腸桿菌的胞漿中擴(kuò)增 80 選擇粗提的層析技術(shù) ? 陰離子交換 : 快速 , 濃縮 ? 樣品處理最簡(jiǎn)單 ? 分離基礎(chǔ) : 電荷 ? 因?yàn)? DACOS 的 酸性 pI 和不穩(wěn)定性，所以緩沖液選擇中性 pH 81 粗提 在 196。KTA? FPLC 上優(yōu)化梯度 線性梯度 步級(jí)梯度 優(yōu)化梯度 層析柱 : HiPrep? 16/10 Q XL 系統(tǒng) : 196。KTAFPLC 0 10 20 30 min 0 100 200 300 100 200 300 400 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 10 20 min 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 10 20 min 82 選擇中度純化技術(shù) ? HIC: 分離基礎(chǔ) : 疏水性 ? 蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預(yù)測(cè) : 篩選適合填料 ? HIC 可以跟 IEX 互補(bǔ)銜接 , 減少樣品處理步驟 (只需要加鹽 ) ? DAOCS 在高鹽下能保持穩(wěn)定 83 選擇精細(xì)純化的層析技術(shù) ? GF:分離基礎(chǔ) : 分子量差異 ? GF: 最適合分離雙體，寡聚體和聚合物 84 DAOCS 優(yōu)化好的粗提步驟 層析柱 : HiPrep? 16/10 Q XL 系統(tǒng) : 196。KTA? FPLC ?濃縮樣品 ?快速去除有害物質(zhì) 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 85 DAOCS 優(yōu)化好的中度純化步驟 層析柱 : SOURCE? 15ISO 內(nèi)徑 16 mm, 長(zhǎng)度 50 mm 系統(tǒng) : 196。KTA? FPLC ? HIC 和 IEX 互補(bǔ) ? 濃縮樣品 ? 除去大部分雜質(zhì) 0 100 200 100 200 300 400 0 ml A 280 nm 86 DAOCS 優(yōu)化好的精細(xì)純化步驟 層析柱 : HiLoad? 16/60 Superdex? 75 prep grade 系統(tǒng) : 196。KTA? FPLC ?去除聚合物和余下的少量污染物 ?交換緩沖液 0 80 60 40 20 100 200 400 600 800 1000 0 ml mAU 87 DAOCS 用 SDSPAGE 分析 4 3 2 1 M M M LMW 低分子量標(biāo)記 1 樣品 2 組份 Q Sepharose? XL 3 組份 SOURCE? 15ISO 4 組份 Superdex? 75 pg 67k 43k 30k 88 DAOCS 純化 結(jié)果 粗提 中度純化 精細(xì)純化 0 80 60 40 20 100 200 400 600 800 1000 0 ml mAU 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 100 200 100 200 300 400 0 ml mAu 89 DAOCS 純化 結(jié)果 DAOCS 的高分辨電子密度圖譜 結(jié)晶 DAOCS 的 X射線繞射圖 感謝瑞典農(nóng)業(yè)科技大學(xué)的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Scheltinga, 以及瑞典 Uppsala 大學(xué)生化系的 Dr. Karin Valeg229。rd 提供以上圖片 90 中度純化 DAOCS 純化 總結(jié) 工藝 優(yōu)化 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 優(yōu)化好的純化流程 樣品準(zhǔn)備 HiPrep? 16/10 Q XL SOURCE? 15ISO HiLoad? 16/60 Superdex? 75 prep grade 粗提 精細(xì)純化 濃縮 60 分鐘 30分鐘 40分鐘 120分鐘 80分鐘 時(shí)間 濃縮 91 196。KTA? 平臺(tái)層析系統(tǒng)純化 DAOCS 結(jié)論 ? DAOCS 純度足夠進(jìn)行結(jié)晶 ? 使用 196。KTA 平臺(tái)層析系統(tǒng)的模板和快速探索 (scouting) 功能可以快捷有效地優(yōu)化純化工藝 ? 純化時(shí)間從 3 天減少到 6 小時(shí) 92 請(qǐng)參考中文網(wǎng)站 93 謝謝 歡迎您隨時(shí)和我們聯(lián)系 北京 (010) 6487 3549 上海 (021) 5080 0260 廣州 (020) 8732 0255 香港 (852) 28117575
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