【正文】 His His His Ni2+ His His is His Ni2+ Ni2+ Ni2+ 15 任何規(guī)模純化都比較簡單 預(yù)裝柱 /填料 一次可純化 注意 融合蛋白的量 His MicroSpin? 〈 100 181。KTA? 系統(tǒng) ? 添加劑兼容 快速，重復(fù)性好和容易使用 18 HiTrap? Chelating 準(zhǔn)備柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗 加樣 用平衡緩沖液沖洗柱子 廢液 收集 用洗脫緩沖液洗脫融合蛋白 收集組份 3 min 515 min 2 min 用平衡緩沖液平衡柱子 廢液 3 min 19 HiTrap? Chelating SDS PAGE Flo w through 加樣 結(jié)合液 洗脫液 結(jié)合液 A A 280 280 A A 405 405 Volume (ml) Eluted pool W ash kDa 14,4 1 2 3 4 5 6 7 8 樣品 : 5 ml大腸桿菌表達(dá)含 (His)標(biāo)記 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶， GST(His)6 柱 : HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 結(jié)合緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 20 mM 咪唑 pH 洗脫緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 500 mM咪唑 pH 流速 : 2 ml/min, 312 cm/h 結(jié)果 : 洗脫 GST(His)6, 4 ml, A280: 總量 : mg 1: 低分子量標(biāo)記 (LMW) 2: 樣品稀釋 1:20 3: 穿透稀釋 1:10 4: 沖洗液 5: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:20 6: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:10 7: GST 標(biāo)準(zhǔn)品 , mg/ml 8: LMW 20 Chelating Sepharose? Fast Flow 適合自行裝柱和放大 ? 每毫升填料可純化高達(dá) 12 mg 融合蛋白 ? 裝在 XK 空柱中和 196。KTA? FPLC 或 196。C 離心 15 分鐘 用 181。m 10 ml/min HiPrep 16/10 DEAE amp。m Q amp。m 苯基 300 cm/hr 小包裝和預(yù)裝柱 57 回收率 載量 精細(xì)純化 目的 ? 達(dá)到最終純度 (去除聚合物 ,結(jié)構(gòu)變異物 ) 最適用層析技術(shù) : 凝焦過濾 /離子交換 / 疏水層析 /反相層析 分辯率 速度 58 精細(xì)純化 : 凝膠過濾填料 Superdex? Peptide Superdex 200 Superdex 75 Mr 3 000 70 000 Mr 100 7 000 Mr 10 000 600 000 分離分子量大小 (球狀蛋白質(zhì) ) 102 103 104 105 106 用 prep grade (34 181。 S 10 181。 S Mini? Beads Q amp。m C2/C18 聚苯乙烯 /二乙烯基苯 120 197。 : 蛋白質(zhì) pH 1 12 (14) 肽類 5, 15 and 30 181。m 離子交換 /疏水層析 /反相層析 反相層析 離子交換 /反相層析 64 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 蛋白質(zhì)性質(zhì) 層析技術(shù) 凈電荷 離子交換 (IEX) 大小 凝膠過濾 (GF) 疏水性 疏水層析 (HIC), 反相層析 (RPC) 生物辯識 (配基特異性 ) 親和層析 (AC) 配基特異性，凈電荷 , 擴張柱床吸附技術(shù) (EBA) 疏水性 有 AC, IEX or HIC 65 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 層析技術(shù) 主要特色 粗提 中度純化 精細(xì)純化 IEX 高分辨率 高載量 快速 HIC 分辨率好 載量一般 快速 AC 高分辨率 高載量 快速 GF 高分辨率 RPC 高分辨率 66 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 層析技術(shù) 樣品起始狀態(tài) 樣品結(jié)束狀態(tài) IEX 低離子強度 高離子強度或 pH 改變 樣品體積不受限制 樣品被濃縮 HIC 高離子強度 低離子強度 樣品被濃縮 AC 特異性結(jié)合 特異性洗脫條件 樣品體積不受限制 樣品被濃縮 GF 樣品體積受限制 交換緩沖液 (5% 總柱體積 ) 流速受限制 樣品被稀釋 RPC 需要有機溶劑 在有機溶劑中，或會損失 生物活性 樣品體積不受限制 67 純化工藝中不同層析技術(shù)的銜接 一般準(zhǔn)則 : ? 結(jié)合互補選擇性的技術(shù)，純化工藝應(yīng)盡量采用不同層析技術(shù) (. IEX, HIC and GF) ? 減少不同層析技術(shù)間的樣品處理 (. 濃縮 , 交換緩沖液 ) ? 盡量簡單 68 銜接層析技術(shù)時注意事項 層析技術(shù) 結(jié)束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強度 IEX 高離子強度或 pH 改變 高離子強度 HIC 低離子強度 特異性結(jié)合條件 AC 特異性洗脫條件 樣品稀釋 交換緩沖液 (如果需要 ) 69 合理銜接不同層析技術(shù) 低溶解度的蛋白質(zhì) SDS 萃取 SDS 萃取 溶解試劑 (尿素 , 乙二醇 非離子性清潔劑 ) GF (在非離子性清潔劑中 ) HIC HIC GF GF 70 合理銜接不同層析技術(shù) 粗 樣或樣品含高鹽 GF 脫鹽 GF 脫鹽 GF 脫鹽 AC IEX HIC 或者需要稀釋 IEX IEX HIC GF 或 RPC GF 或 RPC GF GF 樣品澄清 粗提 中度純化 精細(xì)純化 71 合理銜接不同層析技術(shù) 樣品非常澄清或很稀 AC IEX IEX 沉淀 (. 在高離子強度下 ) HIC 重新溶解 GF 作含高鹽樣品處理 粗提 中度純化 精細(xì)純化 GF 或 RPC GF 或 RPC 72 一種不穩(wěn)定，氧氣敏感酶的純化，結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)測定 Purification of a labile, oxygensensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination 一個可溶性，非融合蛋白質(zhì)的 多維純化 去乙酰氧化頭孢菌素 C 合成酶 Deacetoxycephalosporin C synthase (DAOCS) Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund, Amersham Pharmacia Biotech 聯(lián)合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield, Oxford Centre for Molecular Sciences, Oxford, UK Inger Ande