醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術(shù)-wenkub.com
2025-01-01 04:55 本頁面
【正文】 rd 提供以上圖片 90 中度純化 DAOCS 純化 總結(jié) 工藝 優(yōu)化 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting) 優(yōu)化好的純化流程 樣品準(zhǔn)備 HiPrep? 16/10 Q XL SOURCE? 15ISO HiLoad? 16/60 Superdex? 75 prep grade 粗提 精細(xì)純化 濃縮 60 分鐘 30分鐘 40分鐘 120分鐘 80分鐘 時間 濃縮 91 196。KTAFPLC 0 10 20 30 min 0 100 200 300 100 200 300 400 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 10 20 min 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 10 20 min 82 選擇中度純化技術(shù) ? HIC: 分離基礎(chǔ) : 疏水性 ? 蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預(yù)測 : 篩選適合填料 ? HIC 可以跟 IEX 互補(bǔ)銜接 , 減少樣品處理步驟 (只需要加鹽 ) ? DAOCS 在高鹽下能保持穩(wěn)定 83 選擇精細(xì)純化的層析技術(shù) ? GF:分離基礎(chǔ) : 分子量差異 ? GF: 最適合分離雙體，寡聚體和聚合物 84 DAOCS 優(yōu)化好的粗提步驟 層析柱 : HiPrep? 16/10 Q XL 系統(tǒng) : 196。m 5 181。: 肽類 300 197。RPC SOURCE? RPC 硅膠 3 181。m: Mini Q amp。m) 有 HiLoad? 預(yù)裝柱和小包裝填料 Mr 100 7 000 Mr 3 000 70 000 Mr 10 000 600 000 60 精細(xì)純化 :離子交換填料 Mono? Beads Q amp。 S 1 800 cm/hr 聚苯乙烯 /二乙烯基苯 小包裝 56 中度純化 :疏水層析填料 Sepharose? HP 34 181。 低取代 ) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 Octyl HiTrap? HIC 選擇試劑盒 54 中度純化 目的 ? 去除大部分雜質(zhì) 最適用層析技術(shù) : 離子交換 / 疏水層析 HiLoad? 離子交換和疏水層析預(yù)裝柱 分辯率 快速 回收率 載量 55 中度純化 : 離子交換填料 Sepharose? HP 34 181。 SP XL 90 181。C下高速離心 10 分鐘 ? 用沖洗緩沖液沖洗細(xì)胞沉淀物 包涵體 細(xì)胞破碎 , 沖洗和分離 2 M UREA 20 mM Tris HCl 2% Triton X100 M NaCl 36 溶解和準(zhǔn)備樣品 ? 重新懸浮細(xì)胞沉淀物於 5 ml 溶解緩沖液 (.): 20 mM Tris? HCl, M NaCl, 5 mM 咪唑 , 6 M 鹽酸胍 , 1 mM 2巰基乙醇 pH 8 在室溫等 3060 分鐘 在 +4186。KTA? 系統(tǒng) + Purification HiTrap? HiTrap Modules columns columns 快速，高處理量篩選 ? (GST or (His)6 融合蛋白 ) 非?？焖伲徊郊兓? ? ? (適合大部分融合蛋白 ) 一步純化 ? ? (適合大部分融合蛋白 ) 優(yōu)化以提高純度 ? 常規(guī)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性好 ? 純化后蛋白復(fù)性 ? 32 選擇純化設(shè)備 ? 多步純化 (非融合性蛋白或需要更高純度 ) ? 工藝開發(fā)和優(yōu)化 ? 法規(guī)需要 . GLP/GMP ? 純化工藝放大 ? 轉(zhuǎn)移工藝到更大規(guī)模 使用 196。l 樣品 適合蛋白質(zhì)擴(kuò)增系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化 17 HisTrap? Kit ? 每根 HiTrap? Chelating 金屬螯合柱可在少於 25 分鐘中純化 12 mg 融合蛋白 ? 包含所需濃縮緩沖液和工具 ? 使用針筒，蠕動泵，或者 196。KTA?explorer 10 1: 低分子量標(biāo)記 (LMW) Calibration kit, 還原 , Amersham Pharmacia Biotech 2: 胞漿萃取液 , 1 g /10 ml 3: 洗脫 GST 融合蛋白 10 Glutathione Sepharose? Fast Flow 適合裝填在高效層析柱中和層析系統(tǒng)結(jié)合使用，并用作放大 ? 每毫升填料可以純化 12 mg 融合蛋白 ? 裝在 XK 空柱中和 196。g 立即可用 , 預(yù)裝柱 , Purification Module 緩沖液和試劑 和 MicroPlex? 24 Vacuum 結(jié)合使用可以大大增加處理量 (一次處理 〈 48 樣品 ) GSTrap? 1 ml 10 12 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 GSTrap 5 ml 50 60 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 Glutathione Sepharose? 4B 8 mg / ml 可自行裝柱 Glutathione Sepharose 4 10 12 mg / ml 可自行裝柱，使用層析系統(tǒng)快速純化， Fast Flow 適合放大 6 GST MicroSpin? Purification Module ? 立即可用 , 50 預(yù)裝柱含緩沖液和所需試劑 ? 可純化每柱 400 181。g, 體積達(dá)400 181。KTA? 平臺純化系統(tǒng)連接使用 ? 高流速 ? 兼容尿素，鹽酸胍等 11 GST 融合蛋白的檢測 檢測方法 注意 GST 96 孔板 ELISA 檢測試劑盒 適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份 當(dāng)表達(dá)蛋白的含量不明或需要高靈敏度 時特別有用 GST 酶測定檢測模組 快速測定；適合篩選用途 功能測定 可以有效評估純化出來的 GST 融合蛋白 的活性 ， 但可能需要自行設(shè)計和優(yōu)化 12 GST融合蛋白的檢測 檢測方法 注意 使用抗 GST 抗體和 高度特異 , 只檢測 GST 融合蛋白 ECL? 檢測系統(tǒng)的 使用適當(dāng)濃度的二級 HRP標(biāo)記抗體可以 免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉 ECL 檢測系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測能力 ECL 提供大部分重組表達(dá)應(yīng)用所需的靈敏 度 需要更高靈敏度時使用 ECL Plus. SDSPAGE ＋ Coomassie? 提供分子量大小和 % 純度訊息 . 考馬氏染色或銀染 可檢測融合蛋白和污染物 . 13 GST 96孔板 ELISA 檢測試劑盒 ? 快速酶測定 ? 每塊板可檢測 50 樣品 ? 適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份 14 (His)6 融合蛋白的純化和檢測 重組蛋白
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