醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術(shù)(已修改)
2025-01-16 04:55 本頁(yè)面
【正文】 1 層析分離純化技術(shù) Shanghai Pudong 2 蛋白質(zhì)純化策略 融合蛋白質(zhì) 非融合蛋白質(zhì) 表達(dá) 簡(jiǎn)單純化 一步 親和層析 90 97 % 純度 更高純度 三步純化策略 粗提 中度純化 精細(xì)純化 多步純化 3 簡(jiǎn)易純化選擇 載體和標(biāo)記 純化 pGEX 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 GST MicroSpin? Purification Module, GSTrap?, Glutathione Sepharose? Fast Flow PQE 6 x 組氨酸 His MicroSpin Purification Module pET HisTrap?, HiTrap? Chelating, 6 x組氨酸 Chelating Sepharose Fast Flow pEZZ 18 (非誘導(dǎo)性表達(dá) ) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow pRIT2T (利用溫度改變誘導(dǎo) ) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow 4 GST 融合蛋白的純化 GST 重組蛋白 酶切位點(diǎn) Factor Xa: Mr 1720 000 / 2830 000 Thrombin: Mr 37 000 PreScission? Protease: Mr 46 000 Glutathione Sepharose? Mr 26 000 10C 5 任何規(guī)模純化都比較簡(jiǎn)單 預(yù)裝柱 /填料 一次可純化 GST 注意 融合蛋白的量 GST MicroSpin? 〈 400 181。g 立即可用 , 預(yù)裝柱 , Purification Module 緩沖液和試劑 和 MicroPlex? 24 Vacuum 結(jié)合使用可以大大增加處理量 (一次處理 〈 48 樣品 ) GSTrap? 1 ml 10 12 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 GSTrap 5 ml 50 60 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 Glutathione Sepharose? 4B 8 mg / ml 可自行裝柱 Glutathione Sepharose 4 10 12 mg / ml 可自行裝柱，使用層析系統(tǒng)快速純化， Fast Flow 適合放大 6 GST MicroSpin? Purification Module ? 立即可用 , 50 預(yù)裝柱含緩沖液和所需試劑 ? 可純化每柱 400 181。g, 體積達(dá)400 181。l 樣品 適合蛋白質(zhì)擴(kuò)增系統(tǒng)篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化 7 GSTrap? 柱 ? 20 分鐘內(nèi) ? 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg ? 使用針筒，蠕動(dòng)泵，或者 196。KTA? 系統(tǒng) ? 添加劑兼容 適合快速和重復(fù)性高的要求 8 GSTrap? 結(jié)合緩沖液平衡 加樣后用結(jié)合緩沖液沖洗 廢液 收集 用洗脫緩沖液洗脫 收集組份 3 min 515 min 2 min 9 GSTrap? SDS PAGE analysis 0 20 40 60 80 100 % Elution buffer 0 ml min Wash Elution buffer mg pure GST fusion protein A 280 kD 94 30 43 67 1 2 3 柱 : GSTrap 1 ml 樣品 : 8 ml 大腸桿菌表達(dá)含 GST 融合蛋白胞漿萃取液 結(jié)合緩沖液 : PBS, pH 洗脫緩沖液 50 mM Tris? HCl, pH ＋ 10 mM 還原谷胱甘肽 流速 : 1 ml/min 層析 步驟 : 4 CV結(jié)合緩沖液 , 8 ml 樣品 , 10 CV結(jié)合緩沖液 , 5 CV洗脫緩沖液 , 5 CV結(jié)合緩沖液 (CV = 柱體積 ) 系統(tǒng) : 196。KTA?explorer 10 1: 低分子量標(biāo)記 (LMW) Calibration kit, 還原 , Amersham Pharmacia Biotech 2: 胞漿萃取液 , 1 g /10 ml 3: 洗脫 GST 融合蛋白 10 Glutathione Sepharose? Fast Flow 適合裝填在高效層析柱中和層析系統(tǒng)結(jié)合使用，并用作放大 ? 每毫升填料可以純化 12 mg 融合蛋白 ? 裝在 XK 空柱中和 196。KTA? 平臺(tái)純化系統(tǒng)連接使用 ? 高流速 ? 兼容尿素，鹽酸胍等 11 GST 融合蛋白的檢測(cè) 檢測(cè)方法 注意 GST 96 孔板 ELISA 檢測(cè)試劑盒 適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份 當(dāng)表達(dá)蛋白的含量不明或需要高靈敏度 時(shí)特別有用 GST 酶測(cè)定檢測(cè)模組 快速測(cè)定；適合篩選用途 功能測(cè)定 可以有效評(píng)估純化出來(lái)的 GST 融合蛋白 的活性 ， 但可能需要自行設(shè)計(jì)和優(yōu)化 12 GST融合蛋白的檢測(cè) 檢測(cè)方法 注意 使用抗 GST 抗體和 高度特異 , 只檢測(cè) GST 融合蛋白 ECL? 檢測(cè)系統(tǒng)的 使用適當(dāng)濃度的二級(jí) HRP標(biāo)記抗體可以 免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉 ECL 檢測(cè)系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測(cè)能力 ECL 提供大部分重組表達(dá)應(yīng)用所需的靈敏 度 需要更高靈敏度時(shí)使用 ECL Plus. SDSPAGE ＋ Coomassie? 提供分子量大小和 % 純度訊息 . 考馬氏染色或銀染 可檢測(cè)融合蛋白和污染物 . 13 GST 96孔板 ELISA 檢測(cè)試劑盒 ? 快速酶測(cè)定 ? 每塊板可檢測(cè) 50 樣品 ? 適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份 14 (His)6 融合蛋白的純化和檢測(cè) 重組蛋白 His His His Ni2+ His His is His Ni2+ Ni2+ Ni2+ 15 任何規(guī)模純化都比較簡(jiǎn)單 預(yù)裝柱 /填料 一次可純化 注意 融合蛋白的量 His MicroSpin? 〈 100 181。g 立即可用 , 預(yù)裝柱 , Purification Module 緩沖液和試劑 和 MicroPlex? 24 Vacuum 結(jié)合使用可以大大增加處理量 (一次處理 〈 48 樣品 ) HiTrap? Chelating 1 ml 〈 12 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 HisTrap? Kit 〈 12 mg/柱 含預(yù)裝柱和足夠 12 純化的緩沖液 HiTrap Chelating 5 ml 〈 60 mg 立即可用 , 預(yù)裝柱 Chelating Sepharose? Fast Flow 〈 12 mg/ml 自行裝填到空柱和放大用 16 His MicroSpin? 純化模組 ? 立即可用 , 50 預(yù)裝柱連緩沖液和試劑 ? 每柱可純化達(dá) 100 181。g, 體積達(dá) 400 181。l 樣品 適合蛋白質(zhì)擴(kuò)增系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化 17 HisTrap? Kit ? 每根 HiTrap?
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