醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術(shù)-文庫吧
2024-12-20 04:55 本頁面
【正文】 Chelating 金屬螯合柱可在少於 25 分鐘中純化 12 mg 融合蛋白 ? 包含所需濃縮緩沖液和工具 ? 使用針筒，蠕動泵，或者 196。KTA? 系統(tǒng) ? 添加劑兼容 快速，重復(fù)性好和容易使用 18 HiTrap? Chelating 準(zhǔn)備柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗 加樣 用平衡緩沖液沖洗柱子 廢液 收集 用洗脫緩沖液洗脫融合蛋白 收集組份 3 min 515 min 2 min 用平衡緩沖液平衡柱子 廢液 3 min 19 HiTrap? Chelating SDS PAGE Flo w through 加樣 結(jié)合液 洗脫液 結(jié)合液 A A 280 280 A A 405 405 Volume (ml) Eluted pool W ash kDa 14,4 1 2 3 4 5 6 7 8 樣品 : 5 ml大腸桿菌表達(dá)含 (His)標(biāo)記 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶， GST(His)6 柱 : HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 結(jié)合緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 20 mM 咪唑 pH 洗脫緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 500 mM咪唑 pH 流速 : 2 ml/min, 312 cm/h 結(jié)果 : 洗脫 GST(His)6, 4 ml, A280: 總量 : mg 1: 低分子量標(biāo)記 (LMW) 2: 樣品稀釋 1:20 3: 穿透稀釋 1:10 4: 沖洗液 5: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:20 6: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:10 7: GST 標(biāo)準(zhǔn)品 , mg/ml 8: LMW 20 Chelating Sepharose? Fast Flow 適合自行裝柱和放大 ? 每毫升填料可純化高達(dá) 12 mg 融合蛋白 ? 裝在 XK 空柱中和 196。KTA? 平臺純化系統(tǒng)連接使用 ? 高流速 ? 兼容添加劑 21 檢測 (His)6 融合蛋白 檢測方法 注意 ELISA 測定＋標(biāo)記 IgG 高特異性，只檢測 (His)6 融合蛋白 功能測定 可有效評估純化出來的 (His)6 融合蛋白是否具備 活性 不一定能買到 可能需要自行設(shè)計和優(yōu)化 22 檢測 (His)6 融合蛋白 檢測方法 注意 使用抗 His 抗體和 高度特異 , 只檢測 (His) 6 融合蛋白 ECL? 檢測系統(tǒng)的 使用適當(dāng)濃度的二級 HRP標(biāo)記抗體可以 免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉 ECL 檢測系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測能力 ECL 提供大部分重組表達(dá)應(yīng)用所需的靈敏度 需要更高靈敏度時使用 ECL Plus. SDSPAGE ＋ Coomassie? 提供分子量大小和 % 純度訊息 . 考馬氏染色或銀染 可檢測融合蛋白和污染物 . 23 其他融合 或 非融合蛋白的純化 (1/3) ? 如果有對應(yīng)配基，使用親和層析 ?一步純化 ?高靈敏度 ?高載量 24 其他融合 或 非融合蛋白的純化 (2/3) 立即可用的 HiTrap 柱 應(yīng)用 預(yù)裝柱 抗體分離 所有來源的 IgG， 其亞族，和片斷 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A 包括人源 IgG3 ， 小鼠 IgG1和大鼠 IgG HiTrap Protein G 的 IgG， 其亞族，和片斷 腹水，血請，體液，和細(xì)胞培養(yǎng)液的 MAbTrap? GII (HiTrap Protein G column (1 ml), 單克隆和多克隆 IgG 工具 , 濃縮緩沖液 ) 雞蛋請的 IgY HiTrap IgY 單克隆和人源 IgM HiTrap IgM 25 其他融合 或 非融合蛋白的純化 (3/3) 立即可用的 HiTrap 柱 應(yīng)用： 基團(tuán)特異填料 預(yù)裝柱 白蛋百 , 多種核酸依賴酶 , HiTrap Blue 凝血因子 , DNA 結(jié)合蛋白 , a2巨球蛋白 外露氨基酸 : His (Cys, Trp) HiTrap Chelating 的蛋白和多肽 . a2巨球蛋白和干擾素 生物素和含生物素物質(zhì) HiTrap Streptavidin 凝血因子 , 脂蛋白酶， HiTrap Heparin 膽固醇受體 , 激素 , DNA結(jié)合蛋白 , 干擾素 ,蛋白質(zhì)合成因子 活化好的親和柱自行掛上配基 HiTrap NHSactivated 偶連一級氨基 26 其他融合 或 非融合蛋白的純化 ? 準(zhǔn)備配基 (. 抗體 ) ? 準(zhǔn)備柱子 (. NHSactivated HiTrap?) 現(xiàn)成方法 ? 優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件 ? 使用針筒，蠕動泵，或者 196。KTA? 系統(tǒng)操作的 HiTrap 小柱 制作一支特異親和純化柱 27 其他融合 或 非融合蛋白的檢測 生物活性 Native PAGE IEF MS 分子大小 蛋白質(zhì)酶切 SDSPAGE 免疫印跡 MS N端測序 聚合物 差異性 pH 穩(wěn)定性 , 離子強(qiáng)度 , 蛋白質(zhì)和 清潔劑濃度 結(jié)構(gòu)變異 N端差異 28 去處小分子 ? 純化后 (His)6 融合蛋白的咪唑 ? 酶切后的 GST 或 His 標(biāo)記 ? 多余的鹽 /尿素 /鹽酸胍 ? 用 HiTrap? Desalting 將樣品轉(zhuǎn)移到另一種緩沖液中， . 儲存用或改變 pH 29 交換緩沖液和去鹽的柱子 ? 快速有效 ? 高處理量 ? 去鹽 , 交換緩沖液 , 去掉低分子量物質(zhì) 柱子 樣品體積 樣品洗脫體積 MicroSpin? G25 ml ml HiTrap? Desalting ml ml HiPrep? 26/10 Desalting ml ml 30 交換緩沖液和去鹽的柱子 HiTrap? Desalting 咪唑在鹽峰中一并被去除 0 AU 280nm UV 280 nm 電導(dǎo) (His) 融合蛋白 鹽峰 6 注射 (His)6 融合蛋白 31 選擇純化設(shè)備 純化需要 MicroSpin? Syringe + 196。KTA? 系統(tǒng) + Purification HiTrap? HiTrap Modules columns columns 快速，高處理量篩選 ? (GST or (His)6 融合蛋白 ) 非?？焖伲徊郊兓? ? ? (適合大部分融合蛋白 ) 一步純化 ? ? (適合大部分融合蛋白 ) 優(yōu)化以提高純度 ? 常規(guī)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性好 ? 純化后蛋白復(fù)性 ? 32 選擇純化設(shè)備 ? 多步純化 (非融合性蛋白或需要更高純度 ) ? 工藝開發(fā)和優(yōu)化 ? 法規(guī)需要 . GLP/GMP ? 純化工藝放大 ? 轉(zhuǎn)移工藝到更大規(guī)模
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