醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術(shù)(參考版)
2025-01-07 04:55本頁面
【正文】 KTA? 平臺層析系統(tǒng)純化 DAOCS 結(jié)論 ? DAOCS 純度足夠進行結(jié)晶 ? 使用 196。KTA? FPLC ?去除聚合物和余下的少量污染物 ?交換緩沖液 0 80 60 40 20 100 200 400 600 800 1000 0 ml mAU 87 DAOCS 用 SDSPAGE 分析 4 3 2 1 M M M LMW 低分子量標記 1 樣品 2 組份 Q Sepharose? XL 3 組份 SOURCE? 15ISO 4 組份 Superdex? 75 pg 67k 43k 30k 88 DAOCS 純化 結(jié)果 粗提 中度純化 精細純化 0 80 60 40 20 100 200 400 600 800 1000 0 ml mAU 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 0 100 200 100 200 300 400 0 ml mAu 89 DAOCS 純化 結(jié)果 DAOCS 的高分辨電子密度圖譜 結(jié)晶 DAOCS 的 X射線繞射圖 感謝瑞典農(nóng)業(yè)科技大學(xué)的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Scheltinga, 以及瑞典 Uppsala 大學(xué)生化系的 Dr. Karin Valeg229。KTA? FPLC ?濃縮樣品 ?快速去除有害物質(zhì) 0 100 200 1000 2022 3000 0 0 20 40 60 80 mAU ml mS/cm 85 DAOCS 優(yōu)化好的中度純化步驟 層析柱 : SOURCE? 15ISO 內(nèi)徑 16 mm, 長度 50 mm 系統(tǒng) : 196。KTA? FPLC 上優(yōu)化梯度 線性梯度 步級梯度 優(yōu)化梯度 層析柱 : HiPrep? 16/10 Q XL 系統(tǒng) : 196。m 離子交換 /疏水層析 /反相層析 反相層析 離子交換 /反相層析 64 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 蛋白質(zhì)性質(zhì) 層析技術(shù) 凈電荷 離子交換 (IEX) 大小 凝膠過濾 (GF) 疏水性 疏水層析 (HIC), 反相層析 (RPC) 生物辯識 (配基特異性 ) 親和層析 (AC) 配基特異性，凈電荷 , 擴張柱床吸附技術(shù) (EBA) 疏水性 有 AC, IEX or HIC 65 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 層析技術(shù) 主要特色 粗提 中度純化 精細純化 IEX 高分辨率 高載量 快速 HIC 分辨率好 載量一般 快速 AC 高分辨率 高載量 快速 GF 高分辨率 RPC 高分辨率 66 適用於三步純化策略的層析技術(shù) 層析技術(shù) 樣品起始狀態(tài) 樣品結(jié)束狀態(tài) IEX 低離子強度 高離子強度或 pH 改變 樣品體積不受限制 樣品被濃縮 HIC 高離子強度 低離子強度 樣品被濃縮 AC 特異性結(jié)合 特異性洗脫條件 樣品體積不受限制 樣品被濃縮 GF 樣品體積受限制 交換緩沖液 (5% 總柱體積 ) 流速受限制 樣品被稀釋 RPC 需要有機溶劑 在有機溶劑中，或會損失 生物活性 樣品體積不受限制 67 純化工藝中不同層析技術(shù)的銜接 一般準則 : ? 結(jié)合互補選擇性的技術(shù)，純化工藝應(yīng)盡量采用不同層析技術(shù) (. IEX, HIC and GF) ? 減少不同層析技術(shù)間的樣品處理 (. 濃縮 , 交換緩沖液 ) ? 盡量簡單 68 銜接層析技術(shù)時注意事項 層析技術(shù) 結(jié)束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強度 IEX 高離子強度或 pH 改變 高離子強度 HIC 低離子強度 特異性結(jié)合條件 AC 特異性洗脫條件 樣品稀釋 交換緩沖液 (如果需要 ) 69 合理銜接不同層析技術(shù) 低溶解度的蛋白質(zhì) SDS 萃取 SDS 萃取 溶解試劑 (尿素 , 乙二醇 非離子性清潔劑 ) GF (在非離子性清潔劑中 ) HIC HIC GF GF 70 合理銜接不同層析技術(shù) 粗 樣或樣品含高鹽 GF 脫鹽 GF 脫鹽 GF 脫鹽 AC IEX HIC 或者需要稀釋 IEX IEX HIC GF 或 RPC GF 或 RPC GF GF 樣品澄清 粗提 中度純化 精細純化 71 合理銜接不同層析技術(shù) 樣品非常澄清或很稀 AC IEX IEX 沉淀 (. 在高離子強度下 ) HIC 重新溶解 GF 作含高鹽樣品處理 粗提 中度純化 精細純化 GF 或 RPC GF 或 RPC 72 一種不穩(wěn)定，氧氣敏感酶的純化，結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)測定 Purification of a labile, oxygensensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination 一個可溶性，非融合蛋白質(zhì)的 多維純化 去乙酰氧化頭孢菌素 C 合成酶 Deacetoxycephalosporin C synthase (DAOCS) Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund, Amersham Pharmacia Biotech 聯(lián)合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield, Oxford Centre for Molecular Sciences, Oxford, UK Inger Andersson, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden 73 DAOCS去乙酰氧化頭孢菌素 C 合成酶 DAA = d(Daaminoadipoyl) 主要參與在頭孢菌素和來自鏈絲菌 clavuligerus 中青霉素 N 的頭霉菌素的生物合成 屬于非紅血素類亞鐵依賴性的氧化酶 青霉素 N SNC O O HOD A A N HOD A A N HNSC O O HDAOCS Ring expansion 去乙酰氧化頭孢菌素 C 74 DAOCS 純化策略 純化目標 DAOCSm 15 181。 : 蛋白質(zhì) pH 1 12 (14) 肽類 5, 15 and 30 181。m 硅膠 100 197。m C2/C18 聚苯乙烯 /二乙烯基苯 120 197。m Q, S, Phenyl, Ether, Isopropyl 1 ml 預(yù)裝柱流速高達 10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit 62 精細純化 :反相層析填料 Sephasil? 181。 S Mini? Beads Q amp。 S 25 mg 上樣載量 3 181。 S 10 181。m) 59
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