【正文】 常用的方法有三種： （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） OVER 。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 （ 2）射線照射分離法： 將所需的克隆用鉛板保護(hù)，其余細(xì)胞用 X射線或鈷 60源照射處理。瓷環(huán)、厚壁不銹鋼環(huán)、尼龍或特氟隆塑料環(huán)等都可用作克隆化環(huán)。因此，必須人為地給細(xì)胞群落創(chuàng)建一個(gè)隔離環(huán)境，便于進(jìn)一步分離。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 細(xì)胞克隆形成后，須將克隆分離出來(lái)并進(jìn)行繁殖。實(shí)驗(yàn)證明，惡變細(xì)胞或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂（ %）中的生長(zhǎng)與在裸鼠體上的致瘤性有很大一致性。 瓊脂層制備后，可把細(xì)胞接種在瓊脂層上。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì) 不同細(xì)胞適于在不同的生長(zhǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)。 例如，無(wú)限細(xì)胞系易貼附于塑料瓶壁上，原代培養(yǎng)的細(xì)胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長(zhǎng)基質(zhì)上。 HEPES ( 20 mmol/L）與 2%的 CO2配合使用能保護(hù)細(xì)胞免受培養(yǎng)液 pH值波動(dòng)的影響。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 6） CO2 CO2對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆形成率都有提高作用，常用 5％濃度。地塞米松也能提高人正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等的克隆形成率。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 5）激素和生長(zhǎng)因子 一些激素和生長(zhǎng)因子可促進(jìn)細(xì)胞克隆的形成。飼養(yǎng)細(xì)胞受射線照射后，失去分裂能力，但仍存活并有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力，被作克隆的細(xì)胞散落在飼養(yǎng)細(xì)胞上層與之接觸后，飼養(yǎng)細(xì)胞能促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 4）飼養(yǎng)細(xì)胞 （ feeder cell） 在體外培養(yǎng)時(shí)，單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和增殖，使用飼養(yǎng)細(xì)胞有利于克隆的形成。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆化培養(yǎng)液 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 Eagle MEM Ham 培養(yǎng)液 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 2）培養(yǎng)基 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 3）血清 胎牛血清 作培養(yǎng)液中的血清成分，比 小牛血清 優(yōu)越。 其中 Ham培養(yǎng)液 和 F12K 培養(yǎng)液被證明是最好的克隆化培養(yǎng)液 ,適用于許多細(xì)胞類型。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 （ 1）接種的細(xì)胞密度 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 2）培養(yǎng)基 可用于克隆化的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（見下表）。 （ 1）接種的細(xì)胞密度 克隆形成率與接種細(xì)胞的密度有一定的相關(guān)性 (見下表 )，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度越大，接種時(shí)每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細(xì)胞越多，克隆的形成率就越低。 ④培養(yǎng) 1～ 2d觀察結(jié)果，計(jì)克隆數(shù)。 ③放置于 4℃ 條件下使其凝固。 在瓊脂試管內(nèi)各加入含有不同細(xì)胞 濃度的細(xì)胞懸液 。 2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞： ①將待克隆細(xì)胞用胰蛋白酶溶液消 化，用克隆培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋細(xì)胞 懸液。 ④取完全培養(yǎng)液和 2%瓊脂液配成含有 % 瓊脂的培養(yǎng)液。 ②準(zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，將 2％瓊脂母液加熱融 化后，在室溫下降溫，然后浸人 45℃ 水 浴中。 由于這些細(xì)胞易于懸浮培養(yǎng)，從而逐步發(fā)展了半固體培養(yǎng)基用來(lái)克隆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法。 但瓊脂中含有 酸性硫酸多糖 ，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞有一定的抑制作用。 ④ 觀察并計(jì)數(shù)克隆之?dāng)?shù)目。 ③ 將細(xì)胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的 培養(yǎng)器皿內(nèi)，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞： ① 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物，用胰蛋白酶溶液 消化后制備細(xì)胞懸液。 ② 取 250mg牛血纖維蛋白原 , 800mgNaCl, 25mg檸檬酸鈉 溶于 1000 ml雙蒸水中， 制成 B液 。在細(xì)胞克隆中，用膠原膜層或血纖維膜層代替飼養(yǎng)細(xì)胞，可幫助單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞黏附和貼壁、存活并逐漸繁殖。 但作為生長(zhǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)某些難培養(yǎng)的細(xì)胞尚有應(yīng)用價(jià)值。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 2）飼養(yǎng)層克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 巨噬細(xì)胞 不僅能起飼養(yǎng)作用，還能清除培養(yǎng)體系中的死、傷細(xì)胞及其碎片。 單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和增殖。 ③ 待克隆細(xì)胞：經(jīng)過原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。 （ 1）稀釋鋪板法 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 1）主要實(shí)驗(yàn)材料： ① 培養(yǎng)用液：培養(yǎng)液、消化酶溶液、平衡鹽溶液。 經(jīng)鏡下檢測(cè)，標(biāo)記下含單細(xì)胞的孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 克隆培養(yǎng)技術(shù) 單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)有很多種方法。 適應(yīng)性和活力較強(qiáng)的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群落。但實(shí)際上， 原代培養(yǎng)細(xì)胞 和 有限細(xì)胞系 （二倍體細(xì)胞）比較困難， 無(wú)限細(xì)胞系 、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 和 腫瘤細(xì)胞 則比較容易。 由單一細(xì)胞克隆化形成的細(xì)胞群體，細(xì)胞遺傳性狀差異減少，生物學(xué)性狀均一，利于實(shí)驗(yàn)研究。 細(xì)胞克隆 又稱 單細(xì)胞克隆（ single cell cloning）， 即把單個(gè)細(xì)胞從群體內(nèi)分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 克隆 作為 名詞 使用，是指從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖出來(lái)的細(xì)胞群體。 其實(shí)，這兩個(gè)概念有明顯的區(qū)別， 細(xì)胞株 （ cell strain）強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)物細(xì)胞成分的單一性，所有細(xì)胞的遺傳、生化等特性完全相同； 細(xì)胞系 （ cell line） 雖然并不強(qiáng)調(diào)細(xì)胞的純度，可以包含多種細(xì)胞成分，但主類細(xì)胞應(yīng)占絕大多數(shù)。由原細(xì)胞株再次克隆形成的與原株性狀有部分不同的細(xì)胞群，稱之為 亞株 (substrain) 。 這些特性包括：具有一定 標(biāo)記染色體 、對(duì)某種病毒的 敏感性或抗性 以及具有 特殊的抗原性 等，在以后的培養(yǎng)中 必須持續(xù)存在 。有的無(wú)限細(xì)胞系不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明其已惡性化，可稱之為惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 (malignant transformed cell line）。 連續(xù)細(xì)胞系多為異倍體細(xì)胞。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。根據(jù)細(xì)胞系在體外能否持續(xù)傳代，可將細(xì)胞系分為 有限細(xì)胞系 與 無(wú)限細(xì)胞系 。 細(xì)胞系 是由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型所組成。如果對(duì)原代培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的培養(yǎng)物就稱為 細(xì)胞系（ cell line） 。對(duì)某些研究來(lái)講，必須在細(xì)胞系的基礎(chǔ)上進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以篩選細(xì)胞成分單一的 細(xì)胞株 。 原則上，傳代（繼代）培養(yǎng)的過程就是細(xì)胞系的建立過程。 針對(duì)不同的研究目的，需要對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行純化，以獲得成分相對(duì)單純的培養(yǎng)物。于是，培養(yǎng)物中留下相對(duì)較純的有絲分裂后細(xì)胞。在體外培養(yǎng)時(shí)，給培養(yǎng)液中加入一定量有絲分裂抑