【正文】 胞 應(yīng)占絕大多數(shù)。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 1）細(xì)胞系 （ cell line） 在體外的生存期有限的細(xì)胞系，稱之為 有限細(xì)胞系 （ finite cell line）。 在體外可以持續(xù)生存，具有無限繁殖能力的細(xì)胞系，則稱之為連續(xù)細(xì)胞系 或 無限細(xì)胞系 （ infinite cell line）。有的無限細(xì)胞系（如 NIH3T3,RAT1等）有持久性增殖能力，即永生性或不死性（ immortality），但仍保留接觸抑制，異體接種無致瘤性。 （一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定 基本概念 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 1）細(xì)胞系 （ cell line） （ 2）細(xì)胞株 （ cell strain） 通過選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群稱為 細(xì)胞株 （ cell strain)。 不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限的細(xì)胞株，可稱為 有限細(xì)胞株 (finite cell strain)；可以連續(xù)傳代的細(xì)胞株則稱為 連續(xù)細(xì)胞株（ continuous cell strain),體外培養(yǎng)的細(xì)胞在自然條件或人工誘導(dǎo)下，會在遺傳性狀上發(fā)生變異，形成亞株。 （一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定 基本概念 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 在實際運用中，細(xì)胞系與細(xì)胞株的概念常常被混為一談。 （一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定 基本概念 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 2）細(xì)胞株 （ cell strain） （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 細(xì)胞系中的細(xì)胞類型是不均一的，通過 細(xì)胞克隆（ cell cloning）， 能使培養(yǎng)物從不均一轉(zhuǎn)變?yōu)榫?，使培養(yǎng)物的遺傳可變性減少。細(xì)胞克隆作為 動詞 ，是指分離單一細(xì)胞并使其繁殖為單一細(xì)胞群體的過程。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 原代培養(yǎng) 的細(xì)胞和其它未經(jīng)克隆化的細(xì)胞系都具有異質(zhì)性。 理論上，各種培養(yǎng)細(xì)胞都可用來進(jìn)行克隆培養(yǎng)（ cloning culture）。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆細(xì)胞時，要把細(xì)胞先制備成單細(xì)胞懸液，再接種在培養(yǎng)瓶上，讓細(xì)胞呈單個分布獨立生長。 再取單個細(xì)胞群落進(jìn)行再培養(yǎng)。 根據(jù) 生長基質(zhì) 或 培養(yǎng)物 的性質(zhì)或類型不同，常用的細(xì)胞克隆技術(shù)分為： 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 1）稀釋鋪板法 （ 2）飼養(yǎng)層克隆法 （ 3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法 （ 4）瓊脂克隆法 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 此方法使用稀釋后的低密度細(xì)胞懸液，在多孔塑料培養(yǎng)板各孔中分別接種細(xì)胞懸液，使每孔平均含 1個細(xì)胞。數(shù)日后，凡在已標(biāo)記的孔中有生長增殖的細(xì)胞即為克隆細(xì)胞。 ② 培養(yǎng)用品：包括培養(yǎng)瓶皿、培養(yǎng)板（ 96孔）、吸管、加樣器等。 2）具體操作過程： ① 消化： ② 低密度細(xì)胞懸液的制備： ③ 接種： ④ 標(biāo)記與培養(yǎng)： ⑤ 分離擴(kuò)大培養(yǎng)： （ 1）稀釋鋪板法 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長增殖除了取決于細(xì)胞特性、培養(yǎng)體系和培養(yǎng)條件外，還需要有一定的細(xì)胞密度。 為了促使剛剛克隆化的極少量細(xì)胞生長、增殖，在培養(yǎng)皿中加入能貼壁生長的其它細(xì)胞，稱之為“ 飼養(yǎng)細(xì)胞 (feeder cell)”, 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有 成纖維細(xì)胞 、 胸腺細(xì)胞 和 巨噬細(xì)胞 。因飼養(yǎng)細(xì)胞制備繁瑣，在應(yīng)用稀釋鋪板法克隆細(xì)胞后，已很少有人再用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行克隆細(xì)胞。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 2）飼養(yǎng)層克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 原代培養(yǎng)細(xì)胞容易黏附于 膠原膜層 或 血纖維膜層 等生長基質(zhì)成分之上。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 1）血纖維蛋白膜層的制備： ① 取 g凝血酶溶于 100 ml 克隆培養(yǎng)液中，制成 A液 。 ③ 取 B液 1ml和 A液 4 ml放入培 養(yǎng)皿內(nèi)盡快混合，幾分鐘后 即形成透明膠層。 ② 用克隆培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，一般以每一培養(yǎng) 器皿內(nèi)生長 1～ 10個克隆的細(xì)胞濃度為最適。 每周換培養(yǎng)液 1次。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 瓊脂層是一種簡單的生長基質(zhì)層，可幫助細(xì)胞貼附生長。 然而，對于有些細(xì)胞，特別是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞卻無大影響。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 4）瓊脂克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 1）瓊脂培養(yǎng)液的制備： ①用 Difco瓊脂配成 2％瓊脂母液，經(jīng)高壓 蒸汽消毒后貯存?zhèn)溆谩? ③將完全培養(yǎng)液也浸于 45℃ 水浴中溫育。分裝試管內(nèi)，每管加 ml 瓊脂培養(yǎng)液，仍浸于 45℃ 水浴 中，以保持瓊脂呈液化狀態(tài)。 ②將稀釋后的細(xì)胞懸液浸于冰浴中?；旌虾罅? 即傾入培養(yǎng)皿內(nèi)鋪平。然后 置于 CO２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 4）瓊脂克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 接種眾多單個分散細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后能夠增生形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱 克隆率 或 接種率 (cloning efficiency)，其高低與多種因素有關(guān)。 為提高克隆形成率，須將細(xì)胞懸液稀釋成密度為 10個／ ml，甚至更低，接種的密度也要小。 通過選擇性培養(yǎng)，選定群落形成效率比較高的培養(yǎng)液作為最適的克隆化培養(yǎng)液。 克隆化培養(yǎng)液貯存時久會失去一些有活性的物質(zhì)如谷氨酰胺等，最好做到每 23d新鮮配制一批，并貯于 20℃ 。 用時可先做克隆形成率試驗，選最佳者使用。 飼養(yǎng)細(xì)胞也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線照射傷害處理的、供其它細(xì)胞附著的細(xì)胞層。細(xì)胞克隆形成后，飼養(yǎng)細(xì)胞漸死亡，換液時可被清除。 例如，培養(yǎng)液中含 1～ 10 IU/ml的胰島素能促進(jìn)很多種細(xì)胞克隆的形成。表皮生長因子可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等生長，推薦使用濃度為 1～ 20 ng／ ml。 對有的細(xì)胞，如 人成纖維細(xì)胞 和 膠質(zhì)細(xì)胞 克隆時， 2%的CO2效果可能更好。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應(yīng)性生長基質(zhì) 不同細(xì)胞適于在不同的生長基質(zhì)上生長。 有人證明，用多聚右旋賴氨酸（ polyDlysine）包被培養(yǎng)瓶、皿底壁后，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞克隆形成率。 另一種簡單的生長基質(zhì)層是 瓊脂層 ，常用濃度為 2%。 瓊脂對一些病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和惡性細(xì)胞生長無大影響。因此測試細(xì)胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性的重要指標(biāo)。 常用的方法有三種： （ 1）克隆化環(huán)分離法： 在克隆過程中，形成的細(xì)胞群落在培養(yǎng)皿上分布不均一，而且群落和群落間沒有天然界限。 克隆化環(huán)就是一種可用來隔離克隆的工具?？寺…h(huán)基底必須是光滑的，內(nèi)徑要恰巧將一整個克隆圈進(jìn)，而不碰到鄰近克隆。 （ 3）半固體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細(xì)胞克隆分離法： （略） 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 細(xì)胞克隆形成后，須將克隆分離出來并進(jìn)