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層析分離技術與設備(參考版)

2025-08-04 17:43本頁面
  

【正文】 。 ?清洗方法:以清洗溶液大流量過柱。速度太慢,將增大物質(zhì)的擴散,同樣達不到理想的分離效果。 ?適用:混合物中組分復雜且性質(zhì)差異較小。梯度可以指濃度、極性、離子強度或 pH值等。 ?適用:混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離的場合。 ( 2)分步洗脫 ?按照洗脫能力遞增的順序排列幾種洗脫液,進行逐級洗脫。 ( 1)簡單洗脫 ?概念:柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫,直到層析分離過程結束為止。 ?大規(guī)模生中通過轉換平衡緩沖液閥門與進料閥門進料。通常加樣量應少于 20%的操作容量,體積應低于 5%的床體積。 ?澄清方法:微濾( 1um以下)、離心( 10000g) ?大規(guī)模生中有管路系統(tǒng)完成。 ( 3)平衡液體積 ?一般為 3~5倍柱床體積,以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。 平衡 ( 1)作用 ?使層析介質(zhì)適應操作條件。 ?最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有 2~3cm高的緩沖液,同時關閉出水口。 ?打開出水口,控制適當流速,使吸附劑等均勻沉降,并不斷加入吸附劑溶液。然后用去離子水(或蒸餾水)洗滌干凈并真空抽氣(吸附劑等與溶液混合在一起),以除去其內(nèi)部的氣泡。 ( 2)選柱 ?一般柱子的直徑與長度比為 1:10~50;凝膠柱可以選 1:100~200,同時將柱子洗滌干凈。 二、柱層析的基本操作 裝柱 ( 1)裝柱要求 ?均勻,不能分層,柱子中不能有氣泡等。 ?紫外吸收檢測器用于監(jiān)測蛋白質(zhì)、多肽、核酸等成分的流出。減小進液脈沖,使液流均勻、平穩(wěn)分散于整個柱床表面。 ?—— 合適的分子大小 ( 2) 配體與基質(zhì)的偶聯(lián) 在適宜條件下,使配體上的活性基團與活化后的基質(zhì)上的活性基團反應,使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。 ?—— 配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強的特異性。 ?③ 方法:將適當長度的氨基化合物 NH2 (CH2)n R共價結合到活化的基質(zhì)上。 ?② 間隔臂的長度:太短則效果不明顯;太長則容易造成彎曲,反而降低吸附效率。 ?② 聚丙烯酰胺的活化:一般有以下三種方式:氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。含有伯氨基的配體,如氨基酸、蛋白質(zhì)都可以結合在基質(zhì)上。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 應用 主要用于生物大分子(包括各種蛋白質(zhì)、抗體、激素、維生素、核酸、病毒、細胞等)的分離、純化。 ?具有專一親和力的生物分子對主要有: 抗原和抗體;酶和底物或輔酶或抑制劑;激素和受體; RNA和其互補的 DNA、糖蛋白 植物凝集素 等。 ( 2) 親水性基質(zhì) ?常見的有纖維素( Cellulose)、球狀纖維素( Sephacel)、葡聚糖( Sephadex)、瓊脂糖( Sepharose)等 ?與水有較強的親和力 ?適
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