層析分離技術(shù)與設(shè)備(參考版)
2025-08-04 17:43本頁面
【正文】 。 ?清洗方法：以清洗溶液大流量過柱。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴散，同樣達不到理想的分離效果。 ?適用：混合物中組分復雜且性質(zhì)差異較小。梯度可以指濃度、極性、離子強度或 pH值等。 ?適用：混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離的場合。 （ 2）分步洗脫 ?按照洗脫能力遞增的順序排列幾種洗脫液，進行逐級洗脫。 （ 1）簡單洗脫 ?概念：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。 ?大規(guī)模生中通過轉(zhuǎn)換平衡緩沖液閥門與進料閥門進料。通常加樣量應(yīng)少于 20%的操作容量，體積應(yīng)低于 5%的床體積。 ?澄清方法：微濾（ 1um以下）、離心（ 10000g） ?大規(guī)模生中有管路系統(tǒng)完成。 （ 3）平衡液體積 ?一般為 3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。 平衡 （ 1）作用 ?使層析介質(zhì)適應(yīng)操作條件。 ?最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有 2~3cm高的緩沖液，同時關(guān)閉出水口。 ?打開出水口，控制適當流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。 （ 2）選柱 ?一般柱子的直徑與長度比為 1:10~50；凝膠柱可以選 1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。 二、柱層析的基本操作 裝柱 （ 1）裝柱要求 ?均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。 ?紫外吸收檢測器用于監(jiān)測蛋白質(zhì)、多肽、核酸等成分的流出。減小進液脈沖，使液流均勻、平穩(wěn)分散于整個柱床表面。 ?—— 合適的分子大小 （ 2） 配體與基質(zhì)的偶聯(lián) 在適宜條件下，使配體上的活性基團與活化后的基質(zhì)上的活性基團反應(yīng)，使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。 ?—— 配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強的特異性。 ?③ 方法：將適當長度的氨基化合物 NH2 (CH2)n R共價結(jié)合到活化的基質(zhì)上。 ?② 間隔臂的長度：太短則效果不明顯；太長則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。 ?② 聚丙烯酰胺的活化：一般有以下三種方式：氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。含有伯氨基的配體，如氨基酸、蛋白質(zhì)都可以結(jié)合在基質(zhì)上。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 應(yīng)用 主要用于生物大分子（包括各種蛋白質(zhì)、抗體、激素、維生素、核酸、病毒、細胞等）的分離、純化。 ?具有專一親和力的生物分子對主要有： 抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體； RNA和其互補的 DNA、糖蛋白 植物凝集素 等。 （ 2） 親水性基質(zhì) ?常見的有纖維素（ Cellulose）、球狀纖維素（ Sephacel）、葡聚糖（ Sephadex）、瓊脂糖（ Sepharose）等 ?與水有較強的親和力 ?適
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