【正文】 收集餾分的 SDS PAGE分析圖。收集組分 IVII分別為運行組分（圖上方軸）的 131 202 232 404495 6365和 6871。 PI Step 1： CHTI的結果： CHT ——親和： 純化轉基因羊奶中的重組人 α1抗胰蛋白酶 工藝路線選擇 Step 2：固定化銅親合層析（ IMAC）的結果： 在 CHTI柱純化由 IMAC得到的產(chǎn)品。分部收集組分為 ，收集如下：收集組分 IVIII分別為：運行組分（圖上方軸） 121 232 424 4950、 515 545 6971和 7477。 蛋白質純化策略 1. 樣品準備 2. 捕獲 3. 中間純化 4. 精純 故事剛剛開始 … 層析的目標 ?目標 – 純度 ， Purity (90% vs. ≥ %) – 活性 ， Activity (active vs. inactive) – 含量 ， Quantity (ng or mg levels) – 關鍵雜質的對數(shù)減少 ， Log reductions of key contaminants ? 必須了解的蛋白特性 – 分子量與等電點 – pH、溫度穩(wěn)定性， pH, temp stability – 鹽、去污劑、有機溶劑和金屬離子的影響 Effects of salt, detergents, anic solvents, metal ions – 后轉錄修飾， Posttranslational modifications ? 選擇層析類型 – 變性 /非變性， Denaturing/nondenaturing – 分辨率， Resolution – 得率， Yield – 速度， Speed Before Starting… 蛋白質純化策略 Protein Properties Determine Best Resin Molecular Biology of The Cell, 3rd Ed., Alberts et al + His6 IMAC Ni++, Co++ Protein A Cibacron Blue F3GA OCH3 HIC OCH(CH3)3 CHT Ca++, PO4 Q Resins N+(CH3)3 S Resins SO3 CM Resins CH2COO SEC (GF) DEAE N+H(CH2CH3)2 工藝策略 樣品準備 技術手段：離心，沉淀（硫酸銨、等電點、有機溶劑），過濾，超濾 ?包涵體表達的樣品：菌液分離，包涵體提取和清洗，包涵體溶解，復性 ?細胞周質表達的樣品：菌液分離，反滲透破菌，沉淀和超濾分離 ?細胞和酵母等真核分泌表達的樣品：菌液分離，超濾或直接捕獲純化 ?天然生物材料樣品純化未知蛋白質：不同來源樣品處理方法不同： 各種微生物發(fā)酵液和細胞培養(yǎng)液、動物天然樣品（蛇毒、蟾毒、昆蟲）、植物天然樣品等等 工藝策略 重組蛋白質樣品分析 表達豐度 胞內(nèi)，胞外 表達量：樣品純度 樣品蛋白質濃度 樣品體積 主要雜蛋白：白蛋白，血清蛋白，培養(yǎng)基蛋白，胞內(nèi)各種雜蛋白，內(nèi)毒素等等 包涵體 菌液分離，破菌，提取，含量和純度分析 洗滌： 1%的中性去垢劑，如 Tween、 Triton X100等，加 EDTA和還原劑 2巰基蘇糖（ DTT）、 β巰基乙醇等等，低濃度鹽酸胍或尿素 ? 捕獲 : 快速去除關鍵雜質，例如能降解目標蛋白的組分，如 蛋白酶 等，濃縮樣品，去除高峰度雜質蛋白 ? 中間純化 : 去除大部分殘留的雜質蛋白 ? 精細純化： 去除與目標蛋白性質接近的殘留少量或微量雜質蛋白 工藝策略 工藝策略 菌液分離，澄清 脫鹽 捕獲 中間純化 精純 濃縮 離子交換 親和 CHT羥基磷灰石 疏水 親和 離子交換 凝膠過濾（分子篩） 親和 HPLC 80－ 120um 40－ 80um 10－ 50um 層析介質顆粒大小 各步驟的評價參數(shù) 純度 得率 生物活性 工藝時間 載量 流速 分辨率 得率 工藝策略 各步驟的評價方法 電泳： SDSPAGE， PAGE 蛋白質濃度測定 生物活性測定 HPLC分析 IEX CHT IEX Affinity SEC Ammonium sulfate HIC CHT Affinity SEC Affinity CHT IEX SEC 工藝路線選擇 IEX——IEX MacroPrep High Q和 High S兩步純化 IgM F E A B C D G H | | | | | | | 0 .0 2 . 5 5 . 0 7 . 5 10 .0 12 .5 15 .0 liters AU (2 mm) cond. A 280 D A B C F G E | | | | | | 0 .0 2 . 5 5 .0 7 . 5 10 .0 12 .5 liters AU (2 mm) cond. A 280 High S 的初純 High Q的精純 工藝路線選擇 2 0 0 1 1 6