【正文】 蹤法 。近年來，追蹤極短時間（ 103s以下）內反應過程的方法和裝置已經(jīng)應用。其代表有 停流法（ stoppedflow）和溫度躍變法（ temperature jump）。 III. ? 測酶活所用的反應條件應該是 最適條件 ，所謂最適條件包括最適溫度、最適 pH、足夠大的底物濃度、適宜的離子強度、適當稀釋的酶 IV. 酶活力測定方法： ? 反應計時 。反應計時必須準確。反應體系必須預熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計時。反應到時，要立即滅酶活性，終止反應，并記錄終了時間。終止酶反應，常使酶立刻變性，最常用的方法是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀，也可用 SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應或用破壞其輔因子來停止反應 。 ? 反應量的測定 。測底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測定，所以大都測定產(chǎn)物 具體物質量的測定，據(jù)被測定物質的物理化學性質通過定量分析法測定。常用的方法有： ? 光譜分析法 ：酶將產(chǎn)物轉變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個可用 分光光度法或熒光光度法 測出的化合物。 ? 化學法 ：利用化學反應使產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。 ? 放射性化學法 ：用同位素標記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時間內，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。 I. 酶活力單位 ? 酶活力可用單位時間內單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為 mol/min等。 ? 酶活力單位的基本定義 為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時間內催化完成一定化學反應量所需的酶量。 ? 據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（ activity unit）或又稱酶單位 （ enzyme unit a. 國際單位 ： ? 一般用活力單位 U（ Unit） 表示，許多酶活力單位都是以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成 1μ mol產(chǎn)物所需要的酶量為一個酶活力單位。 ? 一個 “ Katal”單位是指在一定條件下 1秒鐘內轉化 1mol底物所需的酶量。 ? Kat和 U的換算關系： 1 Kat=6 107U， 1U=16067n Kat ? 以上的酶單位定義中，如果底物（ S）有一個以上可被作用的化學鍵，則一個酶單位表示 1分鐘使 1μ mol有關基團轉化的酶量。如果是兩個相同的分子參加反應，則每分鐘催化 2μ mol底物轉化的酶量稱為一個酶單位。 ? 在 “ U”和 “ kat”酶活力單位的定義和應用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計算 。 b. 習慣單位 ： 在實際使用中，結果測定和應用都比較方便、直觀，規(guī)定的酶活力單 ① α 淀粉酶活力單位 ：每小時分解 1g可溶性淀粉的酶量為一個酶單位。（ QB54680），也有規(guī)定每小時分解 1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精 ② 糖化酶活力單位 ：在規(guī)定條件下，每小時轉化可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg還原糖 ③ 蛋白酶 ：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生 1μ g酪氨酸所需的酶量。 ④ DNA限制性內切酶 ：推薦反應條件下，一小時內可完全消化 1μ g純化的 DNA II. 比活力 （ specific activity） ? 酶的比活力是每單位（一般是 mg）蛋白質中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位 /mg蛋白），實際應用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示（如：酶單位 /mL（液體制劑），酶單位 /g（固體制劑）），對同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質越少）， ? 在評價純化酶的純化操作中，還有一個概念就是回收率。 回收率 =某純化操作后的總活力 /某純化操作前的總活力 ［總活力 =比活力 III. 酶活力計算及計算舉例 ? 酶活力計算是將實驗中所用各種參數(shù)和所測得的實驗數(shù)據(jù)（反應時間、酶液稀釋度和用量、產(chǎn)物生成量等）換算成每毫升（或每克）酶制劑中所含的酶活力單位數(shù)。 ? 酶活力測定舉例： 福林 酚（ Lowry）法 測定蛋白酶活力。該方法的基本原理是以酪蛋白為底物進行反應，然后用福林 酚試劑顯色，并用光度法測定酶促反應產(chǎn)物酪氨酸的生成量。測定在初速度階段 本章小結 一、酶 1. 酶的概念 2. 酶催化作用的特點 ① 共性 ② 特性 ：條件溫和、高效率、專一性、易變敏感性 二、酶的化學本質及結構功能特點 I. 酶： 單純酶 結合酶： 全酶 = 酶蛋白 + 輔因子 II. 酶的輔因子 ? 維生素和輔酶 ? 維生素是機體維持正常生命活動所必不可少的一類小分子有機物質。 ? 維生素一般習慣分為脂溶性和水溶性兩大類。 ? 輔酶是一類具有特殊化學結構和功能的化合物 。 參與的酶促反應主要為氧化 還原反應或基團轉移反應 。 ? 大多數(shù)輔酶的前體主要是水溶性 B 族維生素。許多維生素的生理功能與輔酶的作用密切相關。 III. 酶結構與功能特點 (1)活性中心 ： 結合部位、催化部位、調控部位 (2)必須基團 (3)酶原和酶原的激活 (4)同功酶 三、酶的分類及命名 四、酶作用的機制 本質 ：降低反應活化能 中間產(chǎn)（絡合）物學說 E + S ==== ES ??? P + E ： 鎖鑰假說、誘導契合假說 4. 使酶具有高效催化的因素 ? 臨近定向效應 ? “ 張力 ” 和 “ 形變 ” ? 酸堿催化 ? 共價催化 五、酶促反應的速度及其影響因素 ? 米氏方程 ? 米氏常數(shù) Km的意義 :米氏常數(shù)是反應速度為最大值的一半時的底物濃度。米氏常數(shù)的單位為 mol/L。 ? Km值表示酶與底物之間的親和程度： Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低 。 Km值小表示親和程度大 ,酶的催化活性高。 V=V m a x [ S ]K m + [ S ] ? 抑制作用的類型： ? 不可逆抑制作用 ? 可逆抑制作用 a. 競爭性抑制 b. 非競爭性抑制 c. 反競爭性抑制 a b c ：提高酶活力 :在一定條件下酶促反應的速度和酶濃度成正比。 :最適溫度 ：最適 pH （變構）效應 ? 別構酶的特點： ? 一般是寡聚酶 ? 具有別構效應 ? 反應速度和底物濃度關系不符合米曼方程雙曲線 六、酶的分離純化與酶活力測定 ① 基本原則：提取過程中避免酶變性而失去活性 ② 基本操作程序： a. 選材 b. 抽提 c. 分離 d. 純化 ③ 酶的制劑形式與保存 I. 概念 ? 酶活力 ：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學反應的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學反應速度來表示。 II. 酶活力測定就是測定一定量的酶，在單位時間內產(chǎn)物 (P)的生成（增加）量或底物（ S）的消耗（減少）量。即測定時確定 三種量 ：①加入一定量的酶；②一定時間間隔；③物質的增減量。 III. 測定酶活力常有以下幾種方法 ? 初速度法 ? 平均速度法 ? 動態(tài)連續(xù)測定法 ? 快速反應追蹤法 ? 測酶活所用的反應條件應該是最適條件 ? 酶活力測定方法： ? 反應計時 ? 反應量的測定 ：根據(jù)被測定物質的物理化學性質通過定量 分析法測定。常用的方法有：光譜分析法、化學法和放射性化學法。 ? 酶活力單位的基本定義為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時間內催化完成一定化學反應量所需的酶量。 a. 國際單位： “ U” 和 “ Kat” b. 習慣單位 ? 比活力：酶的比活力是每單位（一般是 mg）蛋白質中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位 /mg蛋白）。 ? 回收率 =某純化操作后的總活力 /某純化操作前的總活力