【正文】 產(chǎn)生，那么在 340 nm的光吸收將相應(yīng)地增加。如果，當(dāng)反應(yīng)是 NADH或 NADPH分別氧化為 NAD+或 NADP+時，吸收將會相應(yīng)地降低，因為它們的氧化型在波長 340 nm處不吸收光。 ? 一個實例是乳酸脫氫酶，以乳酸作為底物的活力可依據(jù)下示方程，用隨之增加的 340 nm的光吸收進(jìn)行測定。 34 139 二、酶聯(lián)測定法 許多反應(yīng)，它們吸收光的適合波長不包括底物和產(chǎn)物。在這種情況下測定催化此反應(yīng)的酶，將其與第二個具有特殊吸收光變化的酶反應(yīng)相連接 (linking)(或偶聯(lián) coupling)，通常是可行的。例如，利用葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase)的作用，可經(jīng)常用于測量糖尿病人血液中葡萄糖的濃度，由底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物不造成吸收光的變化。但是，在此反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫能被第二種酶 ——過氧化物酶作用，并把一個無色化合物轉(zhuǎn)化為有色化合物 ——色素原 (chromogen)，它的光吸收能容易地進(jìn)行測量。 35 如要對第一個酶 (葡萄糖氧化酶 )的活力作精確的測量，第二個酶 (過氧化物酶 )和它的共底物或輔酶必須過量，使酶聯(lián)測定不屬限速步驟。這可保證有色色素原的產(chǎn)生速率與 H2O2的產(chǎn)生速率成正比，它的產(chǎn)生又與葡萄糖氧化酶的活力成正比。 140 三、酶速度 酶催化反應(yīng)的速率通常稱作酶速度(velocity)。酶速度通常記錄為時間為零時的值 (V。，單位為 181。mol／ min)，因為產(chǎn)物尚未出現(xiàn)，在這點上速率是最快的。這是因為在任何底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物之前底物濃度是最大的。還因為酶可能受到它本身產(chǎn)物的反饋抑制 (feedbackinhibition)和 /或包括逆反應(yīng)，而且反應(yīng)產(chǎn)物將刺激逆反應(yīng)。 36 ， 141 酶促反應(yīng)形成的產(chǎn)物對時間的典型的圖表明： 產(chǎn)物迅速形成的起始期，構(gòu)成圖形的線性部分 (圖 17)，隨后，酶速度緩慢下降，因為底物已用盡和 /或酶失去活力； Vo的獲得是以零時點 (timepoint)為起點作一與曲線的線性部分相切的直線，這一直線的斜率即等于 Vo。 142 ? 酶活力單位 (enzyme units)可以用許多方式表示。最普通的是被催化的反應(yīng)的起始速度 (Vo)(如每分鐘底物轉(zhuǎn)換的物質(zhì)的量，單位為 181。mol／ min)。也有兩種酶活力的標(biāo)準(zhǔn)單位，即：酶單位 (U)和 “ 開特 ” (kat)。 ? 酶的 1個活力單位是在該酶的最適條件下，在 25℃ ， 1 min內(nèi)催化 1181。mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量 。 ? “ 開特 ” 是酶活力的國際單位 (sⅠ) ，它規(guī)定在特定體系下，反應(yīng)速度為每秒轉(zhuǎn)化 1mol底物所需的酶量 。在兩種不同的酶活力單位之間可用 l181。 mol／ min＝ l U＝ nkat換算。 37 143 ?酶活力 (或總活力 )涉及在樣品中酶的總單位。 ?比活力是每毫克蛋白質(zhì)中酶單位的數(shù)量 (U／ mg)。比活力是酶純度的量度， ?在酶的純化過程中它的比活力增高，當(dāng)酶提純時，其比活力值成為極大和恒定 。 144 四、底物濃度 酶速度對底物濃度 ([S])的依賴關(guān)系的正常模式是，在低的底物濃度下， [S]增加 1倍，將導(dǎo)致起始速度 (Vo)也增加 1倍。然而，在較高底物濃度下，酶被飽和 (saturated),進(jìn)一步增高 [S]，只導(dǎo)致 V。的微小變化。這是因為在有效的飽和底物濃度下，所有酶分子已有效地與底物結(jié)合，這時，總的酶速度依賴于產(chǎn)物自酶解離下的速率，若進(jìn)一步加入底物對酶速度也將不發(fā)生影響。 V。對 [S]的關(guān)系圖形稱為雙曲線(hyperbolic curve) (圖 l8)。 38 145 五、酶濃度 在底物濃度飽和的情況下 (即所有酶分子都與底物結(jié)合 )，酶濃度的加倍將導(dǎo)致 V。的加倍。 Vo與酶濃度的關(guān)系圖為直線圖形。 39 146 六、溫度 ? 溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)的速率。 ? 首先，升高溫度增加底物分子的熱能 (thermal energy)，增高反應(yīng)的速率。 ? 然而較高溫度會帶來第二種效應(yīng)，增加構(gòu)成酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能，也就增加了多重弱的非共價鍵相互作用 (氫鍵、范德華引力等 )破裂的機(jī)會。 ? 這些相互作用維系著整個酶的三維結(jié)構(gòu)，最終將導(dǎo)致酶的 變性(伸展 unfolding)。 ? 酶的三維構(gòu)象甚至微小的變化都會改變活性部位的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化活性的降低。 40 147 ? 升高溫度 以提高反應(yīng)速率的總效應(yīng)是這兩個相反效應(yīng)之間的平衡。因此溫度對 Vo關(guān)系的圖形將為一條曲線，它可清楚地表示出最適溫度 [圖 19(a)]。 ? 多數(shù)哺乳動物的酶，其最適溫度為 37℃ 左右，但也有些生物機(jī)體的兩適應(yīng)在相當(dāng)高或相當(dāng)?shù)蜏囟认鹿ぷ?。例如，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 Taq聚合酶 (Taq polymerase)是在溫泉中、生活在高溫下的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，因此適于在高溫下工作。 148 七、 pH ? 每個酶都有最適 pH，在此 pH下催化反應(yīng)的速率是它的最高值。最適 pH的微小偏離，由于使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化而降低酶的活力。 pH發(fā)生較大偏離時，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多 非共價鍵 受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白自身的變性。 Vo對pH的關(guān)系圖形通常將得到鐘形曲線 [圖 19(b)]。 41 返回 149 ? 許多酶的最適 pH在 ，但是各種酶的最適 pH是多種多樣的，因為它們要適應(yīng)不同環(huán)境進(jìn)行工作。例如，消化酶胃蛋白酶 (pepsin)要適應(yīng)在胃的酸性 pH下工作(大約 )。 150 第五節(jié) 酶動力學(xué)和抑制作用 一、米 曼氏模式 42 米 —曼氏模式 (MchaelisMentonton model)使用如下的酶催化概念： 這里速率常數(shù) (rate constants)k k2和 k3是描述與催化過程的每一步相聯(lián)系的反應(yīng)速度。 151 酶 底物復(fù)合物 酶 (E)與它的底物 (S)結(jié)合形成酶 底物復(fù)合物(ES)。 ES復(fù)合物能重新解離形成 E+S，或能繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)形成 E和產(chǎn)物 P。 假設(shè)：酶與產(chǎn)物 (E+P)的逆向反應(yīng)形成 ES復(fù)合物的速率并不明顯。對許多酶的性質(zhì)的觀察得知，在低的底物濃度 [S]下，起始速度 (Vo)直接與 [S]成正比， 而在 高底物濃度 [S]下，速度趨向于最大值，此時反應(yīng)速率與 [S]無關(guān) [圖 l10(a)]。此最大速度(maximum velocity)稱為 Vmax(單位為 μ mol／ min)。 152 43 返回 42 米 曼氏推導(dǎo)的公式描述出實驗觀察的結(jié)果。米 曼氏公式如下 ： 此公式描述的雙曲線形式，由實驗數(shù)據(jù)在圖 l10(a)中表明。Michaelis 和 Menton在推導(dǎo)此公式時，規(guī)定一新的常數(shù)即 Km，稱為米氏常數(shù) (其單位與物質(zhì)的量濃度相同，用 mol/L)： 返回 45 153 Km？ ? Km是 ES復(fù)合酶的穩(wěn)定性的量度，等于復(fù)合物的分解速率的總和，它大于生成速率。 ? 對許多酶而言， k2比 k3大得多。在這些情況下 Km變?yōu)槊笇λ牡孜锏?親和力 (affinity)的量度。因為它的值分別依賴于 ES生成和解離即 k1和 k2的相關(guān)值。 ? 高的 Km表示弱的底物結(jié)合 (k2大大超過 k1)，低的 Km表示強(qiáng)底物結(jié)合 (k1大大超過 k2)。 Km值可由實驗取得，根據(jù)這一事實，即 Km值等于當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大值 Vmax一半時的底物濃度。 44 154 二、 LineweaverBurk作圖 ? 因為 Vmax是在極大的底物濃度下獲得的，它不可能從雙曲線圖測得 (Km也是如此，見 圖 l10(a))，但是 Vmax和 Km可用實驗求得，即在不同底物濃度下測定 Vo值，然后即可根據(jù) 1／ Vo對 l／ [S]的雙對數(shù) (double reciprocal)或LineweaveBurk制圖 [圖 l10(b)]，此種作圖是從米 曼氏公式衍生得出的： 45 由此公式得出一條直線，在 y軸上截距等于 1／ Vmax， x軸上截距等于 1／ Km直線的斜率等于 Km／ Vmax[圖 110(b)]。 LineweaverBurk圖也是測定抑制劑如何與酶結(jié)合的有用方法 (見下文 )。 155 例外！ 雖然米 曼氏模式對許多酶提供了很好的實驗數(shù)據(jù)模式，但有少數(shù)酶與米 曼氏的動力學(xué)不相符合，如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase)，這些酶稱為變構(gòu)酶 (allosteric enzyme)。 156 三、酶的抑制作用 ? 許多類型的分子有可能干擾個別酶的活性。任何分子直接作用于酶使它的催化速率降低即稱為 抑制劑(inhibitor)。 ?某些酶的抑制劑是正常細(xì)胞代謝物，它抑制某一特殊酶，作為代謝途徑中正常調(diào)控的一部分。其他抑制劑可以是外源物質(zhì)，如藥物式毒物。 ? 這里，酶的抑制效應(yīng)既可以有治療作用，或者是另一種極端，是致命的。酶抑制作用具有以下兩種主要類型： ? 46 157 酶抑制作用具有兩種主要類型： ? 不可逆的 (irreversible)或可逆的 (reversible)?？赡娴囊种谱饔帽旧碛挚稍俜譃?競爭性 的和非競爭性 的抑制作用。 ? 從酶中去除抑制劑能夠制止可逆抑制作用，例如使用透析，但這是有限度的，對不可逆抑制作用則是不可行的。 158 四、不可逆抑制作用 ? 抑制劑不可逆地與酶結(jié)合，它通常是與或靠近活性部位的氨基酸殘基形成 共價鍵 ，永久地使酶失活。 ? 敏感的氨基酸殘基包括 Ser殘基和 Cys殘基具有相應(yīng)的活性的一 OH和一 SH基。 47 159 例如： ? 化合物二異丙基氟磷酸 (DIPF)是神經(jīng)毒氣的組分，在乙酰膽堿酯酶的活性部位與 Ser殘基作用，不可逆地抑制酶，阻滯神經(jīng)沖動的傳導(dǎo) [圖111(a)]。 ? 碘代乙酰胺修飾 Cys殘基，因此，確定酶活性所必需的 Cys殘基是一個或多個作為判斷工具 [圖 111(b)]?？股厍嗝顾夭豢赡娴匾种铺请霓D(zhuǎn)肽酶 (glycopeplide transpeptidase)，它與細(xì)菌細(xì)胞壁上的酶活性部位的 Ser殘基結(jié)合，形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。 160 五、可逆的競爭性抑制 ? 典型的競爭性抑制劑與酶的正常底物有近似的結(jié)構(gòu)，因此它與底物分子競爭地結(jié)合到活性部位 [圖 112(a)]。酶既可以結(jié)合底物分子也可以結(jié)合抑制劑分子，但不能兩者同時結(jié)合 [圖 112(b)]。競爭性抑制劑可逆地結(jié)合到活性部位。在高底物濃度下競爭性抑制劑的作用被壓倒，因為充分的高底物濃度可以將結(jié)合到活性部位的抑制劑分子競爭地排出。因此酶的 Vmax沒有變化，但在競爭性抑制劑存在下，酶對其底物的表觀親和力降低，因此 Km增加。 48 返回 161 ? 琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase)的競爭性抑制作用是個好例子。該酶以琥珀酸 (succinate)為底物，它可被丙二酸(malonate)競爭性地抑制，后者與琥珀酸的區(qū)別是只有一個而不是兩個亞甲基 (圖 113)。 許多藥物是模擬目標(biāo)酶底物的結(jié)構(gòu) ，因此作為酶的競爭性抑制劑而起作用。競爭性抑制作用可用LineweaverBurk圖加以識別，把抑制劑的濃度固定，測定不同底物濃度下的 Vo。在 LineweaverBurk圖上，競爭性抑制劑增加直線的斜率，改變 x軸上的截距 (因為 Km增高 )，但 y軸截距不變 (因為 Vmax維持不變 )[圖 112(c)]。 49 162 六、可逆的非競爭性抑制 ? 非競爭性抑制劑可逆地結(jié)合到除 酶活性部位外的其他位點上 [圖 114(a)]，它使酶總的三維形狀改變，導(dǎo)致催化活性降低。因為抑制劑結(jié)合到與底物不同的酶結(jié)合部位，所以，酶既可以結(jié)合抑制劑，又可以結(jié)合底物，也可以將抑制劑和底物二者一起結(jié)合 [圖 114(b)] 50 返回 163 ? 非競爭性抑制劑的效應(yīng)不能由增高底物濃度而克服，所以 Vmax降低。在非競爭性抑制作用中，酶對底物的親和力不變，因此 Km保持一致。 ? 實例是抑胃酶素 [又名胃 (蛋白 )酶抑制劑， pepstatin]對腎素 (又名血管緊張肽原酶， renin)的作用。 51 非競爭性抑制作用在 LineweaverBurk圖上能識別，因為它提高實驗的直線斜率，改變在 y軸上的截距 (因為Vmax降低 )，而 x軸上的截距不變 (因 Km維持不變 )[圖 114(c)]。