【正文】 由吸附層析發(fā)展起來的 ，是從復雜混和物中純化蛋白質的最好方法。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的 DNA等。 ? 將待純化物質的特異配體通過適當的化學反應共價的連接到載體上，待純化的物質可被配體吸附，雜質則不被吸附， 從層析柱流出， 變換洗脫條件，即可將 欲分離的物質洗 脫下來 ，實現分離提純。 + C C C 配基 蛋白質 固體載體 Affinity chromatography 2. 基質的選擇 理想的基質應滿足以下要求： ① 高度的親水性。 ② 極低的非特異性吸附性（惰性）。 ③ 具有足夠的化學基團。 ④ 適當的多孔性。 ⑤ 較好的理化穩(wěn)定性。 可被應用的基質（載體） ： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 最常用的是瓊脂糖， Sepharose 1B到 10B 3. 配體的選擇 一對可逆結合的生物分子中與載體相偶聯的一方稱配體。 如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。 優(yōu)良配體須具備的條件： 1）與待純化的物質有較強的親和力。 2）具有與基質共價結合的基團。 所要分離的目的產物 相應的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細胞 多糖、糖蛋白、細胞受體 受體、載體蛋白 目的產物與相應的配基 4. 偶聯（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質） 1）基質活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 常用：溴化氰（ CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 如用 CNBr 作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基 2）引入連接臂 （ space arm） 又稱手臂（ spacer ） “ 接臂 ” 的目的： 克服 影響配基與生物大分子的結合的 空間障礙 。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應。如：AHSepharose 4B 常用手臂 5. 操作： 1） 層析前： 制備親和層析劑 選擇 根據欲分離物質特性 配基 選擇 根據配基分子大小及基團特性 載體 2）洗脫： 能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。 包括：非專一性洗脫和專一性洗脫 偶聯 親和層析劑 非專一性洗脫： 改變溫度 改變 pH值 改變離子強度 專一性洗脫： 競爭性洗脫劑（半抗原、抑制 劑、底物類似物） 被吸附物質結合 競爭性地與 配體結合 6. 應用 1）純化大分子物質 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結合碳水化合物的蛋白質）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結構與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質。 (六 ) 高效（壓）液相層析 （ HPLC： High Performance（ pressure） Liquid Chromatography ） ?特點： ①使用的固相支持劑顆粒很細，表面積很大 ,因而分辨率很高。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 固定相（柱填料）： 常用 堅硬、耐高壓 ， 粒度小 的硅膠。 顆粒大小對分辨率的影響 流速為 240ml/hr 流速對分辨率的影響 顆粒大小為 50－ 80目。 洗脫體積（ ml） 1. 基本原理 HPLC是利用樣品中的溶質在固定相和流動相之間分配系數的不同，進行連續(xù)的無數次的交換和分配而達到分離的過程。 許多類型的柱層析都可用 HPLC來代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。 2. 分類 按溶質（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質分類： 親和色譜： —— 親和力 吸附色譜： —— 吸附力 離子交換色譜： —— 離子交換能力 凝膠色譜 ： —— 分子大小而引起的體積排阻 分配色譜： —— 分配系數 分配色譜又可分為： 正相色譜： 固定相為極性，流動相為非極性。 反相色譜： 固定相為非極性，流動相為極性。 用的最多，約占 60～ 70％。 固定相： 硅膠 填料是非極性的，官能團為烷烴。 流動相組成 ：常用 “ 甲醇 — H2O” 。 反相色譜中，蛋白質按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質，越不易與非極性的固定相結合，先被洗脫下來。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強的蛋白質。 3. 色譜儀組成 1）進樣系統(tǒng) 2）輸液系統(tǒng) 3）分離系統(tǒng) 4）檢測系統(tǒng) 5）數據處理系統(tǒng) Principles of Operation for Chromatography Techniques Gel Filtration Ion Exchange Hydrophobic Interaction Affinity Reversed Phase 銜接層析技術時注意事項 層析技術 結束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強度 IEX 高離子強度或 pH 改變 高離子強度 HIC 低離子強度 特異性結合 AC 特異性洗脫 樣品稀釋，緩沖液不變 第三節(jié) 電泳 ? 電泳 （ electrophoresis, EP） ： ? 指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質相反的電極方向移動的過程。 ? 電泳技術 是根據各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行分離的實驗技術 。 一、電泳的基本理論 1. 原理 : ? 在一定 pH條件下（用 buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。 + 遷移率與 內在特性 和 外界條件 有關 內在特性 ：顆粒性質（凈電荷量，顆粒大小、形狀） 外界條件 ：電場強度、溶液性質、支持體特性 將帶凈電荷 Q的粒子放入電場，受到的電引力為： F引 =EQ 在溶液中 ,運動粒子與溶液之間存在阻力 F阻 F阻 = 6πrηV 當 F引 =F阻 時 EQ = 6πrηV EQ V = 6πrη 影響遷移率的因素： 1）顆粒性質： Q越大、 r 越小、形狀越接近球形， v 越快。 2）電場強度： E越高， v越快。 3）溶液性質： ? pH值：離 pI越遠， v越快。（用 buffer保持恒定） ? 離子強度：離子強度越高， v 越低。 原因：離子氛（ ionic atmosphere）。 通常，緩沖液離子強度在 。 4）電滲： 在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。 應避免用高電滲物質作支持介質。 ? 自由界面電泳： 又稱移動界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。 ? 區(qū)帶電泳 :（ zone electrophoresis, ZEP）指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區(qū)帶。 支持介質的作用 :防止電泳過程中的對流和擴散。 2. 電泳的分類 ?按 支持介質種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳 ： 用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分析。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 ?以上兩種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。 ③ 瓊脂糖凝膠電泳 ： 一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。 ④聚丙烯酰胺凝膠電泳 ： 可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分辨率較高。 ?聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖 是目前實驗室最常用的支持介質。 3. 電泳常用設備 （ 1）電泳儀 ： 為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。 常壓電泳儀 （ 600V） 高壓電泳儀 （ 3000V） 超高壓電泳儀 （ 30000V～ 50000V） （ 2）電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽 （ 3） 附屬設備： 水平板式電泳槽 垂直板式電泳槽 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以 聚丙烯酰胺凝膠 作為支持介質的一種電泳方法。 聚丙烯酰胺凝膠是由 丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡稱 Acr）和交聯劑 N， N’ 甲叉雙丙烯酰胺 （ methylane bisacrylamide，簡稱 Bis）在 催化劑 和 加速劑 作用下聚合的。 CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’ 甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1）化學催化系統(tǒng)： APTEMED 催化劑： 過硫酸銨 （ ammonium persulfate， AP） 加速劑： TEMED（ N， N， N’ ， N’ 四甲基乙二胺） 2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（ TEMED） 催化劑 : 核黃素（維生素 B2） 引發(fā)劑 : 光 TEMED的存在，可加速聚合。 . 聚丙烯酰胺凝膠： 丙烯酰胺＋ N,N’ －甲叉雙丙烯酰胺聚合而成 凝膠的機械強度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（ T） 和交聯度（ C）。 T= C= 凝膠濃度越大（?。?，孔徑越?。ù螅?，可分離分子量較?。ù螅┑念w粒 。 Acr與 Bis的重量比應在 30左右。 凝膠濃度和交聯度與孔徑大小的關系 Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% 樣品 分子量（ Da） 適宜的凝膠濃度（％） 蛋白質