【正文】 T= C= 凝膠濃度越大（?。?，孔徑越小（大），可分離分子量較小（大）的顆粒 。 常壓電泳儀 （ 600V） 高壓電泳儀 （ 3000V） 超高壓電泳儀 （ 30000V～ 50000V） （ 2）電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽 （ 3） 附屬設(shè)備： 水平板式電泳槽 垂直板式電泳槽 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以 聚丙烯酰胺凝膠 作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 ④聚丙烯酰胺凝膠電泳 ： 可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 ? 自由界面電泳： 又稱移動界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。 原因：離子氛（ ionic atmosphere）。 + 遷移率與 內(nèi)在特性 和 外界條件 有關(guān) 內(nèi)在特性 ：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀） 外界條件 ：電場強度、溶液性質(zhì)、支持體特性 將帶凈電荷 Q的粒子放入電場，受到的電引力為： F引 =EQ 在溶液中 ,運動粒子與溶液之間存在阻力 F阻 F阻 = 6πrηV 當(dāng) F引 =F阻 時 EQ = 6πrηV EQ V = 6πrη 影響遷移率的因素： 1）顆粒性質(zhì)： Q越大、 r 越小、形狀越接近球形， v 越快。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強的蛋白質(zhì)。 用的最多，約占 60～ 70％。 洗脫體積（ ml） 1. 基本原理 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達到分離的過程。 (六 ) 高效（壓）液相層析 （ HPLC： High Performance（ pressure） Liquid Chromatography ） ?特點： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細(xì)胞 多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體 受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 4. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)） 1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 最常用的是瓊脂糖， Sepharose 1B到 10B 3. 配體的選擇 一對可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。 ③ 具有足夠的化學(xué)基團。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的 DNA等。 2） 洗脫： 用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì) ，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進行分離。 ? DEAE（ QAE） Sephadex A25， A50 CM（ SP） Sephadex C25， C50 A： anion 陰離子 C: cation 陽離子 類型 說明 功能基 反離子 DEAESephadex A25 ， A50 弱堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 氯 QAESephadex A25 ， A50 強堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 —— 2羥丙基 氯 CMSephadex C25 ， C50 弱酸性陽離子交換劑 羧甲基 鈉 SPSephadex C25 ， C50 強酸性陽離子交換劑 磺丙基 鈉 離子交換葡聚糖 離子交換劑的選擇 a. 強、弱離子交換劑的選擇： 強型：適用的 pH范圍廣， 制備無離子水 弱型：適用的 pH范圍窄， 分離生物大分子物質(zhì) b. 陰、陽離子交換劑的選擇： 酶的穩(wěn)定性 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽離子交換劑 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑 2） 蛋白 質(zhì) 的 電荷性質(zhì) P rN H 3+C O O HP rN H 3+C O OP rN H 2C O OO HH +O HH +兼 性 離 子p H = p I陽 離 子p H p I陰 離 子p H p IpH 值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù) 2 4 6 8 10 12 14 0 系統(tǒng) pH + 蛋白質(zhì)帶正電荷 蛋白 質(zhì)帶負(fù)電 荷 等電點 實驗設(shè)計原 理 利用不同的蛋白 質(zhì) 分子在溶液中所 帶電荷 不同，因而 與離子交換劑 有不同吸附力而 分離。 4. 應(yīng)用 1）脫鹽 ２ ) 生物大分子物質(zhì)的 分離純化 3）分子量的測定 4）溶液濃縮 LogM A B C LogM測 V測 LogM=k1k2Ve （ Ve為洗脫體積） 先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。 ? 4）洗脫 ? 洗脫液與平衡時用的 buffer一致。 3. 操作： 1）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。 凝膠型號 顆粒大小/μ m 溶脹體積/(ml/g) 分離范圍（ Mr） Sephadex G10 Sephadex G15 Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G75 Sephadex G100 Sephadex G150 Sephadex G200 4～ 120 4～ 120 50～ 150 50～ 150 40～ 120 40～ 120 40～ 120 40～ 120 2～ 3 ～ 4～ 6 9～ 11 12～ 15 15～ 20 20～ 30 20～ 30 小于 7 102 小于 103 103～ 103 103～ 104 103～ 104 103～ 105 103～ 105 103～ 105 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 2）瓊脂糖凝膠（ agarose gel) 商品名 :Sepharose （瑞典） 。 分配系數(shù) Kd的意義： 1) 可定量地衡量各組分的流出順序。 Sizeexclusion chromatography 凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù) Kd表示： VeVo Kd=———— Vi Vo—— 外水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ ml） Vi—— 內(nèi)水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ ml） Ve—— 某組分的洗脫體積 ，從加進層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ ml） 凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰 Ⅰ . Kd=0時 ,即 Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大 ， 不進入微孔 ， 最先流出 。 選擇： 具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。 硅膠： 常用的極性吸附介質(zhì)。 ? 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。 蛋白 質(zhì) 定量 —— 分光比色 儀 (A280)法 蛋白質(zhì)分子中的 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基 （ 主要是 色氨酸 Trp和酪氨酸 Tyr 的 共軛雙鍵 ） 對紫外光有吸收，以 色氨酸 吸收最強，最大吸收峰為 280nm。 階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的 pH或離子強度。 ? 3）平衡： 層析柱使用前，須用 緩沖液 平衡至所需的 pH值和離子強度 。 Column Chromatography 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備 : 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、紫外檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。 凝膠層析 ：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 層析法的基本原理 ? 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。 應(yīng)用： 脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。 ?超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。 2）透析袋的保存 ： 防腐劑＋冷藏。 一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆粒或分子進行分離的技術(shù)。 ? 3） 解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。 ?特點： 易獲得，強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進入。 功能 溶解非極性物質(zhì) 溶解極性物質(zhì) ? p154 2. 萃取過程 第一步： 將酶從水相中萃取到反膠束相中。 反膠團模型 親水基團向內(nèi)聚集 （正）膠束 反膠束 形成 表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。 ?2) SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體， ? 傳質(zhì)擴散快 。 ? 超臨界流體 (supercritical fluid，SCF） ：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點 —— 臨界點后的流體 。 a 雙節(jié)線 系線 b 雙節(jié)線 均相區(qū) 均相區(qū) 兩相區(qū) 兩相區(qū) 系線 臨界點 PEG/Dx和 PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖 ? 幾種典型的雙水相系統(tǒng) ? 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 ? 葡聚糖（ Dex） ? 羥丙基葡聚糖 ? 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（ Dex） ? 硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇 ? 羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素 ? 聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、 硫酸銨 ? 硫酸鈉、硫酸鎂 2. 萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 萃取操作的 3個步驟： 1）混合 2）分離 3）溶劑回收 ?單級萃取 ? 使用一個混合器和一個分離器 ? 單級萃取流程 93 （二） 雙水相萃取技術(shù) ? 又稱水溶液兩相分配技