【正文】 法。 酶的親和層析一般用瓊脂糖作為母體，選用適宜的配基制成親和層析劑。 親和層析方法 親和層析 分子對(duì)親和層析 免疫親和層析 共價(jià)親和層析 疏水親和層析 金屬離子親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析 分子對(duì)親和層析 定義：利用生物分子對(duì)之間專一而又可逆的性質(zhì)使生物分子分離純化的方法。 酶與底物，酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體等，故分子對(duì)親和層析在酶的分離純化中有重要的應(yīng)用。 在親和層析中控制好溫度， PH等 免疫親和層析 定義 :利用抗原與抗體之間專一而又可逆的親和力使抗體或者抗原分離純化的一種親和層析方法。 免疫親和層析廣泛應(yīng)用于藥物的分離純化，例如工業(yè)制取組織纖溶酶原激活劑。 共價(jià)親和層析 定義 :生物分子的功能性基團(tuán)與層析劑上的配基形成可逆性的共價(jià)鍵的一種分離純化方法。 共價(jià)親和層析可用于純化牛乳巰基氧化酶，從大腸桿菌分離純化青霉素?；傅?。 疏水層析 ? 定義：生物分子上的功能性基團(tuán)與層析劑配基配基形成可逆性疏水鍵結(jié)合的一種親和層系方法。 ? 酶蛋白中常含有疏水性較強(qiáng)的氨基酸 :如亮氨酸，纈氨酸和苯丙氨酸。采用氨基烷和溴化氰活化的瓊脂糖進(jìn)行反應(yīng)，形成改性瓊脂糖。酶可以和改性瓊脂糖的烷基發(fā)生疏水結(jié)合反應(yīng)，從而得以分離。 金屬離子親和層析 定義 :利用生物分子的功能性基團(tuán)和層析劑上得金屬離子形成可逆性結(jié)合的一種分離方法。 蛋白酶類和其他蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸殘基如組氨酸的咪唑基團(tuán)，半胱氨酸的巰基，色氨酸的吲哚基團(tuán)，可與金屬離子親和結(jié)合。用螯合劑將金屬離子（ cu+2,zn+2,co+2等）螯合到母體（如交聯(lián)化的瓊脂糖，葡聚糖 )的表面制成離子親合劑。 洗脫方法：改變鹽的濃度或 PH，降低金屬離子和蛋白質(zhì)之間的親和常數(shù)。 或用競(jìng)爭(zhēng)性試劑如咪唑，組氨酸，色氨酸，半胱氨酸將蛋白質(zhì)置換下來。 洗脫時(shí)，可采用分級(jí)洗脫和梯度洗脫方式。 優(yōu)點(diǎn) :可用不同的金屬螯合到母體上，可用更強(qiáng)的螯合劑將金屬離子洗脫，實(shí)現(xiàn)母體的再生。大多數(shù)情況下，洗脫下的酶仍然保持生物活性。 染料親和層析 ? 定義 :利用生物分子的功能性基團(tuán)和層析劑上染料配基形成的可逆性結(jié)合的一種層析方法。 ? 已經(jīng)成功用于以 NAD+,NADPH+,ATP為輔酶的多種酶的分離純化。 凝集素親和層析 定義：生物分子的功能性基團(tuán)和層析劑上得凝集素形成可逆性結(jié)合的層析方法。 用于各種糖蛋白的分離純化。 層析聚焦 定義 :將酶的兩性等電點(diǎn)和離子的交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的層析技術(shù)。 1離子交換劑和緩沖液體系 （ 1）多緩沖離子交換劑 （ 2）多緩沖溶液 2PH梯度的形成 3層析聚焦的操作過程 層析聚焦的操作過程 （ 1）多緩沖離子交換劑和多緩沖溶液的選擇 （ 2）形成 PH梯度 （ 3）上柱聚焦 （ 4）洗脫 （ 5）再生 電泳分離 定義：帶電粒子向著與自身電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象叫電泳。 在酶學(xué)研究中，電泳技術(shù)主要用于酶的純度鑒定，酶分子質(zhì)量的測(cè)定，酶的等電點(diǎn)的測(cè)定以及少量酶的分離純化。 電泳的分類和影響因素 電泳按支持物體不同分為： 1紙電泳 2薄層電泳 3薄膜電泳 4凝膠電泳 5自由電泳 6等電聚焦電泳 影響因素 1電場(chǎng)強(qiáng)度 2溶液的 PH 3溶液的離子強(qiáng)度 4電滲 5緩沖液的黏度和溫度 紙電泳 紙電泳是以紙為支持物的電泳技術(shù)。 操作過程： 1：支持物的選擇，一般采用層析濾紙為支持物。 2：選擇一定的 PH和一定強(qiáng)度的緩沖液 3：點(diǎn)樣 ,量要適當(dāng) 4：電泳 薄層電泳 薄層電泳 :是將支持體與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層而進(jìn)行的電泳技術(shù)。 支持體：淀粉 纖維素 硅膠 瓊脂 淀粉最為常用，淀粉板薄層電泳廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，核酸和酶的分離。 薄膜電泳 薄膜電泳：醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持體的電泳技術(shù)。 薄膜電泳的分辨力雖然比不上紙電泳和薄層電泳，但此法具有簡(jiǎn)單，快速，區(qū)帶清晰，靈敏度高，易于定量和便于保存的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種酶的分離。 凝膠電泳 凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。 獨(dú)特之處：具有電泳和分子篩的雙重作用。 支持體：聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂凝膠 應(yīng)用：主要用于酶分子質(zhì)量的測(cè)定，酶蛋白和酶RNA的順序測(cè)定以及酶的分離檢測(cè) 等電點(diǎn)聚焦凝膠 等電點(diǎn)聚焦凝膠在酶和其他蛋白質(zhì)的分離中廣泛應(yīng)用。 優(yōu)點(diǎn)： 1分辨率高，可將等電點(diǎn)相差 ~ 位的蛋白質(zhì)分開。 2隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，區(qū)帶越來越窄，而其他電泳由于擴(kuò)散作用越來越寬。 3樣品混合液加在電泳的任何部位，經(jīng)過電泳，由于電聚焦的作用，各組分都可以聚焦到各自等電點(diǎn) PH的位置。 4濃度很低的樣品都可以分離，而且重現(xiàn)好 5可以很準(zhǔn)確地測(cè)定酶和其他蛋白質(zhì)，多肽等兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)。 缺點(diǎn)： 1電泳過程要求使用無(wú)鹽溶液，有些酶和蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液的溶解度較低。 2電泳后各組分都聚焦到各自的等電點(diǎn)，對(duì)某些在等電點(diǎn)時(shí)溶解度低或可能變性的組分不適用。 聚焦電泳的操作過程 1pH梯度支持介質(zhì)的制備 2 電泳 3分離組分的檢測(cè) 8萃取分離 ? 定義：利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。 ? 按照兩相的組成不同，萃取可分為： 1 有機(jī)溶劑萃取 2 雙水相萃取 3超臨界萃取 4反膠束萃取 有機(jī)溶劑萃取 ? 利用物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑的溶解度不同而分離。 ? 由于有機(jī)溶劑容易引起酶和蛋白質(zhì)的失活變性，酶在萃取過程中，在低溫下進(jìn)行，減少酶和有機(jī)溶劑的接觸時(shí)間。 ? 操作過程 1選取合適的有機(jī)溶劑，考慮酶的溶解度和有機(jī) 溶劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。 2將欲分離組分和預(yù)冷的有機(jī)溶劑結(jié)合 3將有機(jī)相和水相分開 4加熱或抽真空盡快使組分和有機(jī)溶劑分開。 雙水相萃取 ? 利用物質(zhì)在互不相容的水相中溶解度不同而分離的方法。 ? 雙水相一般有互不相容的兩高分子水相或者鹽溶液和高分子水相組成。如聚乙醇溶液和葡萄糖溶液。 超臨界萃取 ? 超臨界萃取又稱超臨界流體萃取，使利用物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體的溶解度不同而分離的技術(shù)。 ? 根據(jù)分離方法不同分為： 1等壓分離 2等溫分離 3吸附分離 反膠束萃取 定義：利用反膠束將酶或蛋白質(zhì)從混合溶液萃取出來的一種分離純化技術(shù)。反膠束又稱反膠團(tuán)，是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中形成的納米尺度的一種集體。反膠束是透明的，熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。 9結(jié)晶 1鹽析結(jié)晶 2有機(jī)溶劑結(jié)晶 3透析平衡結(jié)晶 4等電點(diǎn)結(jié)晶 10濃縮與干燥 ? 濃縮除了上述表述的還有蒸發(fā)濃縮 ? 干燥 1真空干燥 2冷凍干燥 3噴霧干燥 4氣流干燥 5吸附干燥