【正文】 勻地鋪在支持板（一般用玻璃板）上，形成薄層，把樣品點到薄層上，用適宜的溶劑展開，利用各組分的移動距離不同，而使個組分分離。 2洗脫劑對混合液中各組分的溶解度大，黏度小，流動性好，容易與被洗脫的組分分離 3有一定的純度，以免雜質對分離的不利影響 常用洗脫劑：石油醚，四氯化碳等 分配層析 定義：利用各組分在兩相的分配系數(shù)不同從而達到各組分分離的層析方法。然而各組分一個接一個，界限不分明，交界處互相混雜，分離效果并不理想。 吸附劑： 固體吸附劑（常用）和液體吸附劑 裝置： 柱形裝置 洗脫方法 : 1：溶劑洗脫法 2：置換洗脫法 3：前緣洗脫法 洗脫方法的曲線及優(yōu)缺點 1溶劑洗脫法 從圖可看出，兩組分有一段“空白”， 即只有不含組分的純溶劑，各組分能很好的分離。當流動相流經固定相時，不同的組分在流動相中以不同的速度流動，從而達到不同組分的分離純化。 離子交換膜點滲析 與電滲析一樣，只是用離子交換膜代替半透膜。操作壓力在 ~13Mpa，分離各種離子和小分子物質，在無離子水和海水淡化有廣泛的應用。 操作壓力： ~ 壓力對超濾流率影響效果較復雜，視具體情況而定。m,操作壓力在 。 膜分離技術 ? 借助一定的孔徑的高分子薄膜，將不同大小不同形狀和不同特性的物質顆?；蚍肿舆M行分離的技術稱為膜分離技術。微濾所截留的顆粒直徑在~2181。m的顆粒，使固形物和液體分離的技術。m 酵母，霉菌，動植物 濾紙 濾布 纖維多孔陶瓷 細胞 固形物 燒結金屬 微濾 ~2181。 ? 離心介質的 PH必須處于酶穩(wěn)定的 PH范圍內，必要時可采用緩沖溶液，過高過低可能引起酶的變性失活，還可能引起轉子和離心機其他部件的腐蝕，應當加以注意。s表示顆粒的沉降系數(shù) 。 ? 等密度梯度離心，是指顆粒完全達到等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。n為轉子 每分鐘的轉數(shù)（ r/min) 。最好用鈦合金的。 等密度梯度離心 ? 密度梯度離心，由于受到密度介質的影響，故分離的顆粒并未達到其等密度位置。 2 密度梯度離心 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質中，使沉降系數(shù)比較接近的物質得以分離的一種區(qū)帶分離方法。主要用于 DNA， RNA，蛋白質等生物大分子以及細胞，病毒等的分離純化，樣品純度系數(shù)的檢測，以及沉降系數(shù)和相對分子質量的測定。 4 離心分離 離心分離 離心機的選擇 離心方法的選用 離心條件的確定 離心機的選擇 1 常速離心機 常速離心機又稱低速離心機，最大轉速在 8000r/min以內，相對離心力（ RCF ）在 1*104g以下，主要用于細胞，細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣的分離，也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。 復合沉淀法 ? 定義：在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物沉淀下來，從而使酶和雜質分離的方法稱為復合沉淀法。 有機溶劑沉淀法 ? 定義：利用酶和雜質在有機溶劑的溶解度不同的特性，通過加入某種特定的一定量的有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶和蛋白質分離的方法。 ? 由于在等電點時，兩性電解質表面的水化膜依然存在，故實際上酶等大分子蛋白質仍有一定的溶解性，從而使沉淀不完全。但用硫酸銨，緩沖能力較差，而且銨離子的濃度會干擾蛋白質的測定，所以有時用其他中性鹽鹽析。 上式子中 ㏒ S=㏒ S0 Ks I=βKs I β為㏒ s0, 主要取決于酶或蛋白質的性質，也和溫度和 PH有關，當溫度和 PH一定時，β為一常數(shù)。 ３沉淀分離 定義：沉淀分離就是改變某些條件或者加入某些物質， 使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他物質分離的技術過程。過量的提取液會使酶濃度降低，對分離純化不利。采用有機溶劑時，溫度控制在０ ~１０ ℃ 低溫條件下。胰蛋白酶可用（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）的硫酸溶液提取 ３ 堿溶液提?。? 適用于在堿溶液溶解度大且穩(wěn)定性好的酶 ，例如Ｌ－天冬氨酸酰胺酶在 ＰＨ１１ ~１２的堿液提取。 外加酶： 革蘭氏陽性菌 溶菌酶破壞 β－１ ,４ 糖苷鍵 酵母菌 β－葡聚糖酶 水解 β1， 3葡聚糖 霉菌 幾丁質酶 植物細胞 纖維素酶，半纖維素 酶和果膠酶 ２提取 定義：在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液的過程，也成為酶的提取。 表面活性劑有離子型和非離子型兩種。 ? 3 超聲波破碎法 ? 利用超聲波發(fā)生器所發(fā)生的聲波或者超聲波的作用，使細胞膜產生空穴（ cavitation)而使細胞破碎的方法。 ? 使用范圍 植物和微生物組織細胞的破碎 ? 3 勻漿法 ? 利用勻漿器產生的剪切力將組織細胞破碎的方法。酶的提取與分離純化 （制作人：王眾 黃文輝 王晨） 要點 １：細胞破碎 ２：提取 ３：沉淀分離 ４：離心分離 ５：過濾與膜分離 ６：層析分離 ７：電泳分離 ８：萃取分離 ９： 結晶 10：濃縮與干燥 1 細胞破碎 ? 細胞破碎是通過各種過程使細胞外層結構破壞的技術過程。必要時加入石英砂等助磨劑。常用的有高壓沖擊法，突然降壓法 及滲透壓變化法 ? 滲透壓變化法是滲透壓突然變化引起的細胞破碎的方法，此法特別適用于膜結合蛋白酶 ﹑ 細胞間質酶等的提取，但對革蘭氏陽性菌不適合，主要是細胞壁由肽聚糖組成，能承受滲透壓的突然變化。 表面活性劑與磷脂及至蛋白相互作用，破壞細胞結構。 自溶法： 自身酶系， 取決于溫度，ＰＨ，離子強度。 核酸類酶（ R酶）的提取，一般在細胞破碎后，用 取，得到核糖核蛋白提取液，在進一步與蛋白質等雜質分離酶ＲＮＡ ２酸溶液的提取： 有些酶在酸性溶液的溶解度大，且穩(wěn)定性好，宜用酸溶液提取，ＰＨ不能太低，以免使酶失活。 影響提取的主要因素 １溫度 溫度對酶的提取效果影響明顯，適當提高溫度，可以增加酶的溶解度和分子擴散速度，但溫度過高會引起酶的變性失活。 ３提取液的體積 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。注意為了保護酶的穩(wěn)定性，可加某些保護劑，如與酶作用的底物，輔酶，某些抗氧化劑。 ? 酶的溶解度和離子強度有確定的定量關系 ㏒ (S/S0)=Ks I