【正文】 凝膠色譜 凝膠色譜 凝膠色譜 ? 常用的商品膠主要有 : 葡聚糖凝膠 sephadex 聚丙烯酰胺凝膠 Biogel 瓊脂糖凝膠 sepharose 商品膠都給出對(duì)球蛋白的最適分段分離范圍 凝膠色譜 ? 凝膠和柱的選擇是根據(jù)被分離物分子量的大小進(jìn)行： ? 1).分離分子量相差較大的兩類物質(zhì)，選擇大分子能被排除，小分子能滲入的凝膠，柱長 :直徑 5:1至 15:1 2).分離分子量相差較小的物質(zhì)，則根據(jù)待提純物的大約分子量，查看分離范圍，選擇適當(dāng)型號(hào)的凝膠。上相主要是 PEG， 下相為右旋糖酐。 六、液－液分離法 ? 雙相水溶液分離法 (aqueous twophase separation) ? 利用酶和雜蛋白在不相混溶的兩相系統(tǒng)中分配系數(shù)不同而達(dá)到純化目的。 ? 由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故而一般 很少單獨(dú)使用 ，更多的是作為其它沉淀法中的一個(gè)組合條件， 但此法有時(shí)可用于對(duì)付雜蛋白種類較多的樣品 ：將 pH調(diào)整至某一值后，不僅會(huì)使處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)沉淀，也可使處于等電點(diǎn)兩側(cè)帶相反電荷的雜質(zhì)形成復(fù)合物而沉淀，從而可除去大量雜蛋白。 ? 在該酶生產(chǎn)菌株的超聲破碎離心上清液中，包含大量的 DNA和雜蛋白。 有機(jī)溶劑沉淀法 ? 用于蛋白質(zhì)純化的有機(jī)溶劑中，丙酮的分離效果最好，引起失效的情況比較少。 二、有機(jī)溶劑沉淀法 ? 有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子間的靜電引力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度下降；也可與水作用使蛋白質(zhì)脫水而趨于凝集、沉淀。 鹽析 ? 鹽析法的一個(gè)發(fā)展就是和色譜技術(shù)相結(jié)合形成鹽析色譜法 (salting out chromatography)， 即以瓊脂糖等非極性物質(zhì)為柱色譜的支持體，在高濃度條件下將樣品中的蛋白質(zhì)鹽析吸附，然后再梯度地降低鹽類濃度，使酶和雜蛋白分別洗脫出來。 球蛋白溶解度 溶液離子強(qiáng)度關(guān)系 鹽析 ? 中性鹽類使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的原因： ? 1).中和蛋白質(zhì)分子表面電荷 ? 2).與蛋白質(zhì)顆粒競爭水分子 ? 不同蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)、帶電數(shù)目及分布等不同，因而可以分級(jí)沉淀。 ? 性質(zhì) 方法 ? 分子大小 離心，超離心法、凝膠過濾， 膜分離技術(shù)（超濾，反滲透， 微孔過濾，透析，電滲析等） ? 溶解度 鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，共沉淀法， 選擇性沉淀法，結(jié)晶 ? 電荷或基團(tuán) 離子交換色譜，電泳，等電聚焦， 吸附 色譜，疏水色譜，聚焦色譜 ? 穩(wěn)定性 選擇性變性法（熱，酸堿， 表面活性劑） ? 特殊（專一性結(jié)合） 親和色譜，親和洗脫，親和電泳 酶的分離純化方法 ? 根據(jù)溶解度不同進(jìn)行的純化 ? 按分子大小進(jìn)行的純化 ? 根據(jù)電學(xué)解離性質(zhì)不同進(jìn)行的純化 ? 利用專一親和作用進(jìn)行的純化 ? 根據(jù)穩(wěn)定性差別建立的純化方法 根據(jù)溶解度不同進(jìn)行的純化 ? 鹽析法 ? 有機(jī)溶劑沉淀法 ? 共沉淀法 ? 選擇性沉淀法 ? 等電點(diǎn)沉淀法 ? 液液分離法 一、鹽析法 ? 鹽析法是最古老的，但也是目前仍廣泛采用的方法。必要時(shí)使用核酸酶。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。 ? 抽提的要求是將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料引入溶液。 丙酮干粉的制備 ? 破細(xì)胞等處理后可將材料制成丙酮干粉 (acetone powder)， 一般程序是： ? 先將材料粉碎、分散，然后在 0℃ 以下的低溫條件下，加入 5~10倍預(yù)先冷至約 20 ℃ 的丙酮，迅速攪拌均勻，隨即過濾，最后低溫干燥，研磨過篩。 ? β葡聚糖酶用于酵母細(xì)胞的破碎。 ? 表面活性劑處理對(duì)膜結(jié)合酶的提取特別有效，在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中均已成功使用。 （ 1）有機(jī)溶劑處理 ? 有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。但對(duì) G+菌不適用。 ? 應(yīng)用時(shí)先將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞從培養(yǎng)液中分離出來，再懸浮在 20%左右的蔗糖溶液中平衡一段時(shí)間，然后離心收集細(xì)胞，迅速投入 4℃ 左右的蒸餾水或低滲溶液中。沖擊壓力可達(dá)每平方厘米幾百至幾千 kg。但難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。 物理破碎法 ? 通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法，統(tǒng)稱為物理破碎法。 ? 此法效率較低 機(jī)械破碎法 ? ? 利用勻漿器所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。 ? 對(duì)一個(gè)方法好壞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是： ? ? 材料選擇及其前處理 ? 動(dòng)物材料：事先剔除結(jié)締組織、脂肪組織 ? 植物材料：果實(shí)種子事先去皮殼，油質(zhì)種子用乙醚等脫脂 ? 微生物發(fā)酵物：先將菌體和發(fā)酵物分離 ? 胞外酶 酶 胞內(nèi)酶 結(jié)酶 溶酶 細(xì)胞破碎 除了動(dòng)植物體液中的酶和微生物胞外酶之外，大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)，因此提取和分離純化前須將進(jìn)行細(xì)胞的破碎。 本章主要內(nèi)容 ? 酶的提取、純化的基本原則 ? 細(xì)胞破碎 ? 酶的抽提 ? 濃縮與初步提純 ? 酶的分離純化方法 ? 酶的純化步驟 ? 酶純化步驟的定量評(píng)價(jià) ? 酶的提純標(biāo)準(zhǔn)及劑型 11. 酶的提取、分離純化 酶的提取、分離純化是將酶從細(xì)胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的、要求相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程 ? 酶的提取包括以下內(nèi)容： ? 材料的選擇及前處理 ? 破細(xì)胞 ? 抽提 ? 濃縮與初步提純 酶的提取、純化的基本原則 一、防止變性失效 二、可以采用比一般蛋白質(zhì)分離更多更有效的方法和條件 三、提取、純化的每一步都應(yīng)進(jìn)行酶活力的檢測 ? 采用的方法應(yīng)兼顧酶的回收和提高酶產(chǎn)品的比活力 注意點(diǎn) ，所有操作都應(yīng)在低溫下條件下進(jìn)行，尤其在有有機(jī)溶劑存在時(shí)更應(yīng)特別小心 2. 大多數(shù)酶在 pH4或 pH 10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個(gè)系統(tǒng)不要過酸或過堿；同時(shí)要避免在調(diào)節(jié) pH時(shí)產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。 ? ，畫出示意圖。 酶分離純化的工藝流程設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的因素： ? 酶源材料 ? 前期工藝過程 ? 產(chǎn)品對(duì)純度的要求 ? 酶存在的狀態(tài) ? 設(shè)備條件 ? 動(dòng)力、原料成本及工時(shí)費(fèi)用 酶分離純化的工藝流程設(shè)計(jì) ? 合理的工藝應(yīng)以降低成本，提高效能，同時(shí)又提高產(chǎn)品純度和質(zhì)量為前提。 ? ? 利用研缽、石磨、球磨 (不銹鋼或玻璃珠直徑 )、細(xì)菌磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎，必要時(shí)可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化鋁等作為助磨劑。 ? 此法細(xì)胞破碎程度較高，對(duì)酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。 ? 此法對(duì)較脆弱的細(xì)胞效果較好。 ? （ 1）高壓沖擊法是在結(jié)實(shí)的容器中裝入菌體細(xì)胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或沖擊錘加高壓沖擊之，使細(xì)胞破碎。 壓力差破碎法 ? （ 3）滲透壓差法是利用滲透壓的變化而使細(xì)胞破碎?？捎糜趶暮Ｑ笪⑸镏刑崛∧承┟浮? ? 常用的試劑可分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類。 ? 在酶的提取方面一般采用非離子型的 Triton、Tween等表面活性劑。 ? 如溶菌酶能專一作用于肽多糖的 β1， 4糖苷鍵，常用于 G+ 菌的細(xì)胞破碎。 ? 必要進(jìn)可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等殺菌劑 ? 此外可通過加入噬菌體去感染細(xì)胞，或通過電離輻射等方法，使細(xì)胞自溶。 酶的抽提（萃取、提取） ? 酶的抽提是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。 抽提劑 ? 由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。沉淀法可濃縮并去除部分雜質(zhì)，此外，濃縮的方法有 ? （ 1）蒸發(fā)法 ? （ 2）反復(fù)凍融法 ? （ 3）膠過濾 ? （ 4）超濾法 ? 除去大分子的核酸和粘多糖 ? （ 1）加硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。 酶的分離純化方法 ? 現(xiàn)有的酶的分離純化方法都是根據(jù)酶和雜蛋白在下列性質(zhì)上的差異建立的。鹽析純化法就是根據(jù)酶和雜蛋白在高鹽濃度的溶液中溶解度差別差別而建立的一種純化方法。 ? 此法優(yōu)點(diǎn)：簡便，安全，重現(xiàn)性好 ? 缺點(diǎn)：分辨率低，純度提高不顯著，同時(shí)為了下一步純化，有時(shí)還需要脫鹽。 ? 在一定的鹽和離子強(qiáng)度條件下（ Ks、 I為常數(shù) ），通過改變溫度或 pH值使不同物質(zhì)分離，稱 ?分段鹽析。 ? 缺點(diǎn)：溫度控制不當(dāng)時(shí)易引起變性。 共沉淀法 例子 ? 以聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI)純化限制性內(nèi)切核酸酶 RE. EcoR I為例。 ? .,PA