資料一核酸分離純化(編輯修改稿)
2025-06-18 01:59 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 同，如果提取質(zhì)粒量很大，多次提取。 F、質(zhì)粒溶解不充分：洗脫溶解質(zhì)粒時，加溫或延長溶解時間 G、洗脫液加入位置不對：加在硅膠膜中心部位 確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜表面達(dá)到最大洗脫效率 H、洗脫體積太?。合疵擉w積對回收率有影響。洗脫體積增大，回收率增高 I、洗脫時間太短：洗脫時間對回收率有影響。洗脫時放置一分鐘可達(dá)到較好效果 質(zhì)粒 DNA抽提常見問題分析 (二 ) Q質(zhì)粒純度不高 A、混有蛋白：減少菌量。如果混有蛋白懸浮物，再次離心去除 B、混有 RNA： RNase A處理不徹底，減少菌量 C、混有基因組 DNA：加入溶液后要溫和混勻 劇烈振蕩會剪碎基因組 DNA，混雜在質(zhì)粒中 細(xì)菌培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞和 DNA的降解，不要超過 16 小時。 D、菌株含大量核酸酶：降解質(zhì)粒 DNA，影響質(zhì)粒 DNA完整性 選用不含核酸酶的宿主菌，如 DH5α和 Top10 E、裂解時間過長：請參考說明書推薦流程 F、質(zhì)粒二 /多聚體形式：復(fù)制時形成，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢出 三、凝膠 DNA回收 過柱方法： MEGAspin Agarose Gel Extraction Kit(價格優(yōu)勢，優(yōu)先推薦 ) 凝膠 DNA回收， 100bp10kb， 20分鐘， 7090％ MEGAquickSpin PCRamp。Agarsose Gel DNA Extraction Kit 凝膠、 PCR或酶切產(chǎn)物回收， 87bp20kb， 20分鐘，效率 95％ MEGAbead Agarose Gel DNA Extraction Kit 凝膠 DNA回收， 87bp20kb， 20分鐘，效率 95％ EzWay Gel Extraction Kit（價格過高） 凝膠回收， 100bp10kb， 20分鐘，效率 7080％ 非過柱方法： DNA Extraction Kit 凝膠回收，非過柱， 120bp， 20分鐘，效率 80％ 分離示意圖 分離原理 高鹽濃度情況下，硅石與DNA結(jié)合 低鹽濃度情況下，硅石與DNA分離 簡要流程 ? 結(jié)合 ? 洗滌 ? 洗脫 凝膠 DNA回收常見問題分析 Q未回收或回收得率較低 A、膠塊未完全溶解：加熱水浴，確保膠塊完全溶解 B、膠塊太大：切小膠塊，分多次回收或者選用大型回收試劑盒 C、電泳緩沖液 PH值太高：引起 DNA無法結(jié)合或者結(jié)合效率過低，調(diào)節(jié)到 高鹽及低 PH結(jié)合 DNA，低鹽及高 PH條件洗脫 D、洗脫緩沖液不何時： EB或水較合適，洗脫效率較高 E、洗脫液加入位置不對：加在硅膠膜中心部位 確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜表面達(dá)到最大洗脫效率 Q回收片段無法用于后續(xù)實驗，如連接 A、洗滌液殘留：洗脫前離心或 50度烘烤 5分鐘，徹底除去洗滌液 B、瓊脂糖污染，凝膠未全部溶解 C、洗脫產(chǎn)物中含 ssDNA：表現(xiàn)為瓊脂糖電泳出現(xiàn)小彌散帶 95度加熱后退火使單鏈
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