層析分離純化技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-17 19:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ml BIgG @ 600 cm/hr ? 高 流速 ，低反壓 －操作壓力 : 2 bar @ 1200 cm/hr with 20 cm ? 更高的堿穩(wěn)定性 – 短期 : M NaOH @ RT for 1 week – 長期 : Storage in M NaOH @ RT for 1 year ? 生產(chǎn)效率大大提高 離子交換層析 UNOsphere Q/S性能參數(shù) Ca 2 + PO 3 4 Crystal Formation Crystal Drying And Granulation Sintering At High T emperature 羥基磷灰石（ CHT） 合成 ? Ca10(PO4)6(OH)2 ? 5 個(gè)帶正電荷的 Ca離子對(duì)（ C位點(diǎn)） ? 2 個(gè)磷酸三價(jià)離子，每個(gè)含有帶 6個(gè)負(fù)電荷的氧原子（ P位點(diǎn)） ? 2 個(gè)羥基 ? 于其他層析介質(zhì)不同， CHT的骨架是化學(xué)反應(yīng)的表面 CHT陶瓷羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu) 羥基磷灰石（ CHT） T y pe I T y pe I IF u n cti o n a l g ro u p Ca 10 (P O 4 ) 6 (OH ) 2 Ca 10 (P O 4 ) 6 (OH ) 2S i n ter i n g Te m p e ra t u re 4 0 0 176。 C 7 0 0 176。 CS u rfa c e a r ea ( m2/ g ) 4 2 4 9 m2/g 2 2 2 4 m2/gP o re size (197。 , n o m i n a l ) 5 0 0 197。 8 0 0 197。P a c k i n g d e n sity (g / m l ) 0 . 5 4 5 6 0 . 5 4 5 6M a x . P re ssu re ( p si/ b a r) 9 0 0 / 6 0 1 5 0 0 / 1 0 0P ro tein C a p a cityLy so zy m e, m g / g 2 5 1 2 . 5羥基磷灰石（ CHT） 產(chǎn)品類型與參數(shù) ? 蛋白質(zhì)帶正電氨基 ? 經(jīng)典的陽離子交換 ? 用中性鹽溶液 (NaCl) 或緩沖鹽溶液 (PO4)洗脫 羥基磷灰石（ CHT） 初級(jí)保留機(jī)制 ? 帶負(fù)電羧基 ? 經(jīng)典的金屬螯合作用，并受離子排阻調(diào)節(jié) ? 比離子間靜電相互作用強(qiáng)15–60倍 ? 在無 PO4 條件下不能被任何濃度 NaCl洗脫 ? 用 PO4洗脫 初級(jí)保留機(jī)制 羥基磷灰石（ CHT） ? 大部分大分子蛋白質(zhì)以兩種保留機(jī)制聯(lián)合模式結(jié)合：Ca親和與陽離子交換 ? 酸性蛋白質(zhì)的結(jié)合，如白蛋白（ albumin）以鈣親和作用為主，陽離子交換僅有輕微的作用，這意味著 NaCl對(duì)白蛋白載量和保留的影響是非常有限的。 ? 堿性蛋白質(zhì)，如 IgG以陽離子交換作用為主，其載量和保留受 NaCl影響顯著 注： 對(duì)于帶負(fù)電荷的酸性蛋白質(zhì)，無論樣品是否含有NaCl，都對(duì)上樣時(shí)的吸附載量和保留無影響，這意味著可以將捕獲階段獲得的中間體樣品無需脫鹽處理即可上樣到 CHT上進(jìn)行高分辨率中間純化 羥基磷灰石（ CHT） 混合保留機(jī)制 Type I ?由于具有更高的表面積， I型具有更高的蛋白載量，而且具有更大的保留 . Type II ?由于具有大孔結(jié)構(gòu)， II 型具有更高的核酸載量，能分離單鏈和雙鏈 DNA，和超螺旋與非超螺旋的 DNA ?白蛋白不能與 II型結(jié)合，對(duì)于一些含白蛋白的抗體樣品，II型分離純化更有利 . ?大分子重組疫苗的中間純化和大規(guī)模制備 如何選擇類型 羥基磷灰石（ CHT） 分離純化原理與操作參數(shù)選擇 羥基磷灰石（ CHT） 影響蛋白質(zhì)色譜行為的操作參數(shù)： CHT類型 NaCl濃度 PB緩沖液濃度梯度 雙梯度洗脫 PB緩沖液梯度含不同 NaCl濃度 緩沖液 pH值 雙梯度洗脫模型 先以 0500mM NaCl，再以 0500mM 磷酸鉀 不同類型 CHT陶瓷羥基磷灰石在不同 pH下不同蛋白質(zhì)的保留時(shí)間（ min） 羥基磷灰石（ CHT） ? 基于生物分子表面疏水性不同而達(dá)到分離的技術(shù) ? 疏水作用來自于分子的水化結(jié)構(gòu)，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合 ? 不同離子的疏水性 – Anions: SO42 Cl Br NO3 ClO4 I SCN – Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ ? 蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫 原理 疏水層析 MacroPrep Methyl HIC MacroPrep tButyl HIC 產(chǎn)品 操作參數(shù)選擇 疏水層析 ?疏水介質(zhì)選擇：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白質(zhì)：丁基，苯基 ?鹽：硫酸銨，醋酸銨等等 ?緩沖體系和 pH ?洗脫梯度 Definition Separation of proteins based on reversible interactions between a protein and a specific ligand coupled to the stationary phase Affinity Chromatography Principle ? Profinity IMAC——純化 Histagged Protein ? Chelex 100——純化 DNA， PCR樣品制備 ? AffiGel Protein A——純化單克隆抗體 ? Dye AffiGel Blue (DEAE or CM) ——純化單抗，分離 HSA ? AffiGel 肝素凝膠 ——多種蛋白，如凝結(jié)因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 ? AffiGel Polymixin——去除內(nèi)毒素（熱原） ? AffiGel 硼膠 ——分離核苷酸、核苷、兒茶酚胺、糖類等小分子 親和層析 產(chǎn)品與應(yīng)用 Profinity IMAC Resins 固定化金屬螯合層析： Immobilized Metal Affinity Chromatography （ IMAC） ? 基于純化重組組氨酸標(biāo)記蛋白設(shè)計(jì)，專門純化 Histagged Protein 螯合帶電離子，如 Zn2+,Ni2+,Cu2+, 現(xiàn)有的產(chǎn)品為螯合 Ni2+的介質(zhì) ? UNOsphere 技術(shù) 更好的流動(dòng)特性，在高流速下載量，目的蛋白得率和純度不會(huì)受到影響。 IDA Cartridges BioScale Mini Cartridges Profinity IMAC Ni金屬螯合 ——純化 HisTagged重組蛋
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