酶的分離純化ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 20:18 本頁面
【文章內容簡介】 間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 性質 方法 ? 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾 ? 溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀 ? 電荷 電泳、離子交換層析 ? 吸附性質 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析） ? 對配體分子 親和層析 的生物親和力 主要是利用 鹽析 法、等電點 沉淀 、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低 . 粗分級分離 細分級分離 ? 一般蛋白質樣品經粗制分級后，體積較小，雜質大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的 柱層析及電泳 方法。 ? 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。 ? 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。 ? 另外，結晶也是蛋白質分離純化的方法之一，制備的結晶物常常作為蛋白質結構分析之用。 Back 第三節(jié) 沉淀分離 改變某些條件，使溶液中某種溶質溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達到與其它溶質分離。 是酶分離純化常用的方法之一。 其本質是降低溶液的溶解度。 方法有鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復合沉淀等 ,表 43. 在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質和酶因溶解度各不相同而分離。 鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度？ 鹽在溶液中離解為正負離子，反離子作用改變蛋白酶分子表面的電荷；同時離子存在改變水活度使分子表面水化膜改變。 一、鹽析沉淀法 『 鹽溶 』 是加鹽使蛋白質融入水中， 『 鹽析 』 是加鹽使蛋白質沉淀出來。兩者所加的鹽類不同，其作用機制也毫無關系。 在低鹽濃度下 ,蛋白質和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加 鹽溶 鹽析 鹽濃度升高到一定濃度后 ,蛋白酶的溶解度又隨著鹽濃度升高而減少 ,蛋白酶沉淀析出 . 一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區(qū)域，就越容易用硫酸銨沉淀下來。 式中： S、 So： 蛋白質或酶在離子強度為 I和 0時的溶解度（ g/L） Ks： 鹽析常數(shù)，取決于鹽的性質和酶的結構 I： 離子強度 ,與離子濃度 mi和離子價數(shù) Zi有關。 I=1/2∑m iZi2 酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度的關系式： 蛋白質和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強度有密切的關系 β =LogSo ： 取決于酶的性質，也與溫度和 pH有關。 Ks：主要取決于鹽性質。與離子價數(shù)成正比，與離子半徑與溶液介電常數(shù)成反比。 β 與 Ks確定后，蛋白酶溶解度決定于 I Ks分段鹽析 : T、 pH一定下改變離子強度 β 分段鹽析 : 一定鹽和離子強度下，改變 T、 pH 常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。 鹽析所需添加飽和硫酸銨體積式： 溫度和 pH一定時， So為常數(shù)， ? 不同的蛋白質分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)蛋白質的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質分別沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%飽和度 飽和 析出 析出 分段鹽析 ? 常用的鹽析劑是硫酸銨，因為它的鹽析能力強，在水中的溶解度大，價格便宜，濃度高時也不會引起蛋白質活性喪失。 ? 鹽析沉淀的蛋白質仍保持天然構象，即仍有活性。 ? 蛋白質用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進一步精提純。脫鹽常用 透析法 。 透析 是將含有小分子雜質的蛋白質溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水中進行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質被除去。 透析袋 蛋白質溶液 蒸餾水 利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質（如酶、蛋白質、氨基酸等）具有不同的等電點這一特性進行分離純化的方法。 等電點時，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白質仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶液中除雜和與其它方法聯(lián)系使用。 二、等電點沉淀法 圖例 介電常數(shù) 溶質分子之間的引力 溶解度 有機溶劑 溶質分子周圍的水膜破壞
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