酶的分離純化ppt課件-在線瀏覽
2025-02-22 20:18本頁(yè)面
【正文】 醇辛基苯基醚 )。對(duì)膜結(jié)合酶的提取特別有效。 簡(jiǎn)單原理 :溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。于生理食鹽水或 ，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。 革蘭氏陽(yáng)性菌：細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形狀依賴于壁上的肽多糖， 溶菌酶 能專一性作用于肽多糖的 β 1， 4糖苷鍵。 酵母：其細(xì)胞壁的主要成分是 β 1， 3葡聚糖，需加 β 葡聚糖酶 ； 霉菌：其細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)，可用 幾丁質(zhì)酶 ； 植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。 自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。于溫室 30℃ 左右較早溶化。 自溶溫度選在 0～ 4℃ ，因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。也稱酶的抽提。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。 鹽溶現(xiàn)象 : 在一定濃度的鹽存在下 ,酶的溶解度增加 . 鹽析現(xiàn)象 : 當(dāng)鹽的濃度太高 ,蛋白的濃度反而下降 ,從溶液中析出 .一般采用稀鹽溶液， ~。 。 一、酶提取的主要方法 鹽溶液提取 蛋白質(zhì)提取液的 pH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。 酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。 與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶需用有機(jī)溶劑提取。一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。 因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解 10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。 少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。 pH值 為了防止酶的變性， pH不宜過高或過低；溶液的pH值應(yīng)遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)，以增加酶的溶解度。 ? 從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為 粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離 兩步進(jìn)行。 性質(zhì) 方法 ? 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾 ? 溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 ? 電荷 電泳、離子交換層析 ? 吸附性質(zhì) 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析） ? 對(duì)配體分子 親和層析 的生物親和力 主要是利用 鹽析 法、等電點(diǎn) 沉淀 、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低 . 粗分級(jí)分離 細(xì)分級(jí)分離 ? 一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。 ? 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。 ? 另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。 是酶分離純化常用的方法之一。 方法有鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀等 ,表 43. 在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶因溶解度各不相同而分離。 一、鹽析沉淀法 『 鹽溶 』 是加鹽使蛋白質(zhì)融入水中， 『 鹽析 』 是加鹽使蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)。 在低鹽濃度下 ,蛋白質(zhì)和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加 鹽溶 鹽析 鹽濃度升高到一定濃度后 ,蛋白酶的溶解度又隨著鹽濃度升高而減少 ,蛋白酶沉淀析出 . 一旦蛋白質(zhì)溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無(wú)法有效隔離蛋白質(zhì)的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸引，因而沉淀下來(lái)。 式中： S、 So： 蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為 I和 0時(shí)的溶解度（ g/L） Ks： 鹽析常數(shù)，取決于鹽的性質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu) I： 離子強(qiáng)度 ,與離子濃度 mi和離子價(jià)數(shù) Zi有關(guān)。 Ks：主要取決于鹽性質(zhì)。 β 與 Ks確定后，蛋白酶溶解度決定于 I Ks分段鹽析 : T、 pH一定下改變離子強(qiáng)度 β 分段鹽析 : 一定鹽和離子強(qiáng)度下，改變 T、 pH 常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%飽和度 飽和 析出 析出 分段鹽析 ? 常用的鹽析劑是硫酸銨，因?yàn)樗柠}析能力強(qiáng)，在水中的溶解度大，價(jià)格便宜，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。 ? 蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。 透析 是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃
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