酶工程3酶的分離純化-在線瀏覽
2025-07-13 22:00本頁面
【正文】 大分子物質(zhì)去除。 四、酶溶液的濃縮 — 冷凍干燥法 — 蒸發(fā)法： — 超過濾法： — 膠過濾法： — 干燥 冷凍干燥法 —— 先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。 超過濾法 —— 將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。 其它方法 —— 吸水劑如用聚乙二醇 (PEG)處理小量樣品。 —— 方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥 第三節(jié) 酶分離純化的基本過程 一、酶分離純化方法的選擇 目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時，要考慮以下幾個方面： ? — 首先對待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解； ? — 以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)； ? — 嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。 物質(zhì)之間得以分離的主要依據(jù)就是組分間的物化性質(zhì)的差異 。 因此 ，生物體系的物化性質(zhì)的研究應(yīng)成為一個重點(diǎn) 。 這種保持生物質(zhì)特性不至于改變的措施就是所謂的穩(wěn)定性維持 。 這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目和序列不同造成的 。 此外 ， 多肽可折疊成非常確定的二級結(jié)構(gòu) (?螺旋 、 ?折疊和各種轉(zhuǎn)角 )和三級結(jié)構(gòu) ， 形成獨(dú)特的大小 、 形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況 。 酶分離純化方法 — 根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 — 根據(jù)溶解度建立的分離純化方法 — 根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法 — 根據(jù)親和作用建立的分離純化方法 — 根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法 ．．．．．． 一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 —— 透析 —— 超過濾 —— 離心 —— 凝膠過濾等。有多種型號和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（ ?1?102D）；商品名為 spectrapor等。 透析袋 酶溶液 蒸餾水 透析裝置和過程 超過濾 利用壓力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。 超濾器類型 —— 有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。 （ 1）離心機(jī)的種類和用途 （ 2）沉降系數(shù) S （ 3）離心方法的選擇 差速離心 密度梯度離心 等密度離心 （ 4）離心條件的確定 離心力 離心時間 離心溫度和 pH值 梯度離心 密度梯度 在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大 ,向上逐漸減小 蔗糖 便宜 ， 純度高 ， 濃溶液 （ 60％， w/w） 密度可達(dá) 。 需要高密度和低滲透壓的梯度時 ， 可用 Ficoll代替蔗糖 。 凝膠過濾 凝膠過濾 Tubes march in from left A280 Fraction 部分使用的擔(dān)體 目前使用最廣泛的擔(dān)體材料： ※ 交聯(lián)后的葡聚糖凝膠 ※ 聚丙烯酰胺 ※ 瓊脂 ※ 其它物料 二、根據(jù)溶解度建立的分離方法 鹽析 (Salting Out)法 降低介電常數(shù)法（有機(jī)溶劑沉淀 法） 等電點(diǎn)沉淀法 共沉淀法 選擇性沉淀法： 鹽析法 最常用的是硫酸銨。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時）。 ? 直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表”。 影響介電常數(shù)的主要因素： —— 溫度 —— 有機(jī)溶劑 —— 離子強(qiáng)度 —— pH值： 溫度： —— 在 0℃ 下進(jìn)行操作；有機(jī)溶劑必須冷至 15~ 20℃ ，邊攪拌邊緩慢加入，沉淀析出后迅速離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解沉淀。 pH值 —— 盡可能接近酶的等電點(diǎn) pI 等電點(diǎn)沉淀法 —— 酶在等電點(diǎn)處容易發(fā)生沉淀 共沉淀法 —— 一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（ PEG） ,聚乙烯亞胺（ PEI）單寧酸，硫酸鏈霉素以及表面活性劑（ SDS）等在一定條件下可以直接或間接與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀析出 ,再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜怼Ｈ缇郾┧幔?PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。 （ 3）離子交換吸附法 —— 離子交換色譜法 —— 利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。 離子交換劑應(yīng)滿足下列要求： （ 1） 有高度的不溶性 ，即在各種溶劑中進(jìn)行交換時，交換劑不發(fā)生溶解 （ 2） 有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積 ，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換 （ 3） 有較多的交換基團(tuán) （ 4） 有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì) ，在使用過程中，交換劑不能因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。 電泳法 —— 在直流電場中
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