11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-在線瀏覽
2024-09-26 02:05本頁(yè)面
【正文】 反應(yīng)介質(zhì) 適用于特殊反應(yīng)體系和酶類 適合的酶類還不普遍 改進(jìn)酶性能的方法 蛋白質(zhì)工程概念： 是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和改造。 二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。 因此按預(yù)定方案通過對(duì)編碼該蛋白質(zhì)基因的改造，就可以獲得新型的蛋白質(zhì)分子 。 ?間接法： 從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來(lái)推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 三、蛋白質(zhì)工程的主要手段 蛋白質(zhì)工程的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是創(chuàng)造人類所需要的各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。 以重組 DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。通過改變特定氨基酸來(lái)獲得突變體酶，以改變天然酶的催化活性、底物特異性或穩(wěn)定性。 合理設(shè)計(jì)的技術(shù)需求 三類專家： ①蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的專家； ②蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的專家； ③基因工程的專家。 分子設(shè)計(jì)專家： 在了解了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后，主要通過理論的方法，提出蛋白質(zhì)改性的設(shè)計(jì)方案，這一方案將提供改性后的蛋白質(zhì)哪些部分的氨基酸順序與天然蛋白質(zhì)不同，這些新的序列可以導(dǎo)致怎樣的空間結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的變化，從而能賦予新蛋白質(zhì)什么樣的特性。 基因工程專家： 在得到了新的蛋白質(zhì)的改性設(shè)計(jì)方案之后，就用一套分子生物學(xué)的技術(shù)，先合成相應(yīng)的基因模板，再經(jīng)過克隆與表達(dá)，得到新蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，最后通過分離、純化，提取出足夠純的新蛋白質(zhì)以研究它的性質(zhì)。 ? 酶定點(diǎn)突變常用技術(shù)： ? 1. 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 ? 2. PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 ? 3. 盒式突變 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 盒式誘變 注意事項(xiàng) ① 改造對(duì)象有沒有測(cè)定出空間結(jié)構(gòu)。 ② 結(jié)構(gòu)和生物功能的聯(lián)系是否明確。 ③ 所選對(duì)象的重要性。 ④ 是否易于進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和最后的基因工程生產(chǎn)。 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。 ? 所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制 (隨機(jī)突變、重組和自然選擇 )，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 酶分子定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵 ? 定向進(jìn)化是一個(gè)由構(gòu)建突變體庫(kù)，突變體表達(dá)，表達(dá)后篩選三個(gè)步驟組成的循環(huán)遞進(jìn)過程，需要： ? (1) 產(chǎn)生包含大量帶有微量有利突變的突變體的文庫(kù) 。 ? (3) 必須有一種靈敏的篩選方法 ,能反映出由一個(gè)氨基酸的置換而引起的預(yù)期性狀的較小提高。 ?連續(xù)易錯(cuò) PCR (sequential error prone PCR)策略。 DNA改組和外顯子改組 ? DNA改組 (DNA shuffling)又稱有性 PCR (sexual PCR)，原理如圖所示。 體外隨機(jī)引發(fā)重組 體外隨機(jī)引發(fā)重組 (random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短 DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短 DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們 互為引物 進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長(zhǎng)度。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度。 ? 微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到 96孔板上檢測(cè)吸光度。 ? 微球細(xì)胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。 突變體分離 突變酶分子的高通量篩選策略 檢測(cè)培養(yǎng)基篩選法 ? 通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥物，使培養(yǎng)后發(fā)生某種可以辨別的變化，如培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周圍顏色的變化，由此區(qū)別不同類型或生理特性不同的微生物。 基于比色法和熒光檢測(cè)的高通量篩選 基于檢測(cè)培養(yǎng)基篩選法的，生色基團(tuán)或熒光基團(tuán)的底物參加的催化反應(yīng)是最容易實(shí)現(xiàn)高通量篩選的。 ? 使用比色計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)顯色或熒光底物， pH指示劑顯色反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移還可以實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時(shí)檢測(cè)。 ?采用放射性同位素標(biāo)記底物進(jìn)行脂酶的篩選取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種方法靈敏而且準(zhǔn)確，但由于放射性其使用會(huì)受到限制無(wú)法推廣使用。 ?隨著生物催化在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用，對(duì)手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，同時(shí)產(chǎn)品價(jià)值的提高也將使得很多借助復(fù)雜儀器設(shè)備的高成本的檢測(cè)方法成為可能并將逐漸得到更多的應(yīng)用。 ? 定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。
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