【文章內(nèi)容簡介】 的凝膠。葡聚糖凝膠主要由 Pharmacia Biotech生產(chǎn)。常見的有兩大類，商品名分別為 Sephadex和 Sephacryl。 ?葡聚糖凝膠中最常見的是 Sephadex系列，它是葡聚糖與 3氯 1,2環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成，交聯(lián)度由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制。 ?Sephadex 的主要型號是 G10 ~ G200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率（單位是 ml / g干膠）乘以 10。如 Sephadex G50，表示吸水率是5ml/g干膠。 ?Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的 Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。 Sephadex中排阻極限最大的 G200為 6 105。 ?Sephadex在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復(fù)使用。 ?Sephadex穩(wěn)定工作的 pH一般為 2~10。強(qiáng)酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免 Sephadex與強(qiáng)酸和氧化劑接觸。 ?Sephadex在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在 100 ℃ 下 40 min對凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。 ?Sephadex含有羥基基團(tuán)，呈弱酸性，可與分離物中的一些帶電基團(tuán)（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。但一般在離子強(qiáng)度大于 ，幾乎沒有吸附作用。 ?Sephadex進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)時(shí)常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，避免其與蛋白發(fā)生吸附。 ?鹽濃度不宜過高，否則會引起凝膠柱床體積發(fā)生較大的變化。 ?Sephadex G25和 G50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，形成 LH型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為 Sephadex LH20和 LH60，適用于以有機(jī)溶劑為流動相，分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。 ?Sephadex有各種顆粒大?。ㄒ话阌写?、中、細(xì)、超細(xì)）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。要根據(jù)分離要求來選擇顆粒大小。 ?Sephadex的機(jī)械穩(wěn)定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細(xì)顆粒要求流速較慢，所以不能實(shí)現(xiàn)快速而高效的分離。 ?Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（ N, N‘methylenebisacrylamide）交聯(lián)而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。 ?Sephacryl的優(yōu)點(diǎn)就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達(dá)到 108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 Sephadex的范圍。 ?不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒、甚至較大的病毒顆粒。 ?Sephacryl與 Sephadex相比另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性更高： Sephacryl在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫。 ?Sephacryl穩(wěn)定工作的 pH一般為 3~11。 ?Sephacryl的機(jī)械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以 Sephacryl相比 Sephadex可以實(shí)現(xiàn)相對比較快速而且較高分辨率的分離。 聚丙烯酰胺凝膠 ?聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺（ acrylamide）與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。 ?主要由 BioRad Laboratories生產(chǎn)，商品名為 BioGel P，主要型號有 BioGel P2 ~ BioGel P300等 10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的 103，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。 ?聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于 Sephadex。排阻極限最大的 BioGel P300為4 105。 ?聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機(jī)溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。 ?聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在 pH為1~10之間比較穩(wěn)定。 ?在較強(qiáng)的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發(fā)生分解。 ?聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，吸附效應(yīng)較小。對芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液就可以避免。 ?聚丙烯酰胺凝膠不會象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。 瓊脂糖凝膠 ?瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖是由 D－半乳糖（ Dgalactose）和 3,6－脫水半乳糖（ anhydrogalactose）交替構(gòu)成的多糖鏈。 ?它在 100℃ 時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度降至 45℃ 以下時(shí)，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。 ?瓊脂糖凝膠的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見的主要有 Pharmacia Biotech生產(chǎn)的 Sepharose（ 2B ~ 4B）和 BioRad Laboratories生產(chǎn)的 Biogel A等。 ?瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小。 ?瓊脂糖凝膠在 pH為 4－ 9之間是穩(wěn)定的，它在室溫下很穩(wěn)定，穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。 ?瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時(shí)洗脫速度可以比較快。 ?瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。 ?瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以 0－ 30℃ 為宜。 ?Sepharose與 2,3二溴丙醇反應(yīng)，形成Sepharose CL型凝膠（ CL2B ~ CL4B） ?分離特性基本沒有改變，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都有所提高，可以在更廣泛的 pH范圍內(nèi)應(yīng)用，穩(wěn)定工作的 pH范圍為 3~13。 ?Sepharose CL型凝膠還特別適合于含有有機(jī)溶劑的分離。 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠 ?這類凝膠是由交聯(lián)的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內(nèi)部的瓊脂糖組成。它們主要由 LKB提供，商品名為 Ultragel。 ?由于含有聚丙烯酰胺，所以有較高分辨率；而它又含有瓊脂糖，這使得它又有較高的機(jī)械穩(wěn)定性，可以使用較高的洗脫速度。 ?調(diào)整聚丙烯酰胺和瓊脂糖的濃度可以使Ultragel有不同的分離范圍。 多孔硅膠、多孔玻璃珠 ?這類凝膠是由硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。 ?屬于硬質(zhì)無機(jī)凝膠，最大的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度很高、化學(xué)穩(wěn)定性好，使用方便而且壽命長。 ?無機(jī)膠一般柱效較低，但用微粒的多孔硅膠制成的 HPLC柱也可以有很高的柱效，可以達(dá)到 4 104塔板 /米。 ?多孔玻璃珠易破碎，不能填裝緊密，柱效相對較低。 ?多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬 ?多孔硅膠一般為 102~5 106 ?多孔玻璃珠一般為 3 103~9 106。 ?最大缺點(diǎn)是吸附效應(yīng)較強(qiáng)（尤其是多孔硅膠），可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。 ?另一個(gè)缺點(diǎn)是它們也不能用于強(qiáng)堿性溶液，一般使用時(shí) pH應(yīng)小于 。 ?另外值得一提的是各類凝膠技術(shù)近年來發(fā)展得很快，目前已研制出很多性能優(yōu)越的新型凝膠。 ?例如 Pharmacia Biotech的 Superdex和Superrose ? Superdex的分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好，可以用于 FPLC、 HPLC分析。 ? Superose的分離范圍很廣，分辨率較高，可以一次性的分離分子量差異較大的混合物。同時(shí)它的機(jī)械穩(wěn)定性也很好。 凝膠的選擇、處理和保存 凝膠的選擇 ?分離范圍 ?凝膠顆粒的大小 ?實(shí)驗(yàn)條件 一方面，根據(jù)分離范圍來選擇合適型號的凝膠 ?一般的凝膠層析實(shí)驗(yàn)可以分為兩類：分組分離（ group separations）和分級分離（ fractionations） ?分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等。 ?分級分離是指將一組分子量比較接近的組分分開。 選擇凝膠另外一個(gè)方面就是凝膠顆粒的大小 ?顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，有時(shí)會造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重。 ?顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。選擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定， ?例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。 ?由于凝膠一般都比較穩(wěn)定，所以它在一般的實(shí)驗(yàn)條件下都可以正常的工作。 ?如果實(shí)驗(yàn)條件比較特殊，如在較強(qiáng)的酸堿中進(jìn)行或含有有機(jī)溶劑等等，則要仔細(xì)查看凝膠的工作參數(shù)，選擇合適的類型的凝膠。 凝膠的處理 估算出凝膠的用量 ?由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無水的干膠，所以要計(jì)算干膠用量： ）凝膠的床體積（）柱床體積（）干膠用量（g/mLmLg ??由于凝膠處理過程以及實(shí)驗(yàn)過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計(jì)算的基礎(chǔ)上再增加10％－ 20％。 干膠的膨化 ?一般吸水率較小的凝膠（即型號較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時(shí)間較短，在 20℃ 條件下需 3~4小時(shí) ?吸水率較大的凝膠（即型號較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時(shí)間則較長， 20℃ 條件下需十幾個(gè)到幾十個(gè)小時(shí)。 ?如 Sephadex G100以上的干膠膨化時(shí)間都要在 72小時(shí)以上。如果加熱煮沸，則膨化時(shí)間會大大縮短，一般在 1~5小時(shí)即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。 ?瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理。 ?外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。 純化和排除氣泡 ?純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細(xì)小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時(shí)間，再用水洗至中性。 ?排除凝膠中的氣泡可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。 凝膠的保存 ?凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦ǔ＜尤?％的疊氮化鈉， 4℃ 下保存。 ?如果要較長時(shí)間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在 50％的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復(fù)浸泡脫水，至 95％乙醇脫水后將凝膠抽干。置于 60℃ 烘箱中烘干，即可裝瓶保存。 ?膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。 凝膠層析操作中應(yīng)注意的問題 層析柱的選擇 凝膠柱的鑒定 洗脫液的選擇 加樣量 洗脫速度 層析柱的選擇 ?層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進(jìn)行選擇。 ?一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。 ?一般柱長度不超過 100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。 ?層析柱的直徑和長度比一般在 1:25~1:100之間。 ?用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。 凝膠柱的鑒定 ?柱填裝后肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡。 ?通?？梢圆捎靡环N有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖 202血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。 ? 如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用。 ? 如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。 ?有時(shí)為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質(zhì)預(yù)先過柱，以消除吸附。 洗脫液的選擇 ?由于凝膠層析的分離機(jī)理簡單以及凝膠穩(wěn)定工作的 pH范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品。 ?一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。 ?為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 加樣量 ?加樣要盡量快速、均勻。 ?加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果。 ?加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。 ?分級分離時(shí)，加樣體積約為凝膠柱床體積的1％ ~5％左右，而分組分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％ ~25％。 洗脫速度 ?一般洗脫速度要恒定而且合適。通常有兩種方法：恒流泵和恒壓重力洗脫。 ?洗脫速度取決于很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等。 ?一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。 ?洗脫速度過慢會造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會大大延長。 ?一般凝膠的流速是 2~10 cm / h，市售的凝膠一般會提供一個(gè)建議流速，可供參考。 凝膠層析的應(yīng)用 生物大分子的純化 分子量測定 脫鹽及去除小分子雜質(zhì) 去熱源物質(zhì) 溶液的濃縮 去熱源物質(zhì) ?熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)。