生化分離技術第七章_層析技術(編輯修改稿)
2025-02-08 15:34 本頁面
【文章內容簡介】 1． 流動相與固定相 層析法根據流動相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。而固定相有 固體、液體和以固體為載體的液體薄層。生物物質一般存在于水溶液中，因此，生物分離主要采用液相層析法，如固定相為液體的分配層析法，如固定相為固體的吸附層析法及固定相為固定于固體表面的液體薄層（以固體為載體）的分配層析法等。 2．固定相的形狀 根據固定相或層析裝置形狀的不同 ， 液相層析法又分紙層析法 ( Paper chromatography)、 薄層層析法 ( Thin— 1ayer chromatography)和柱層析法 (Column chromatography)。 紙層析和薄層層析多用于分析目的 ， 而柱層析易于放大 ， 適用于大量制備分離 ， 是主要的層析分離手段 。 3． 壓力 在以固體 (包括以固體為載體的液體薄層 )為固定相的液相層析中 ， 根據操作壓力的不同 ， 又分為低壓 (壓力一般小于)、 中壓 (壓力為 ～ 40MPa)和高壓 (壓力為 ～40MPa)液相層析法 。 高壓液相層析法中層析介質 （ 固定相 ）微細 ， 分離精度高 、 速度快 ， 主要用于成分分析 。 大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 一 、 原理與操作 1． 凝膠層析的原理 凝膠過濾層析 (Gel filtration chromatography， GFC)又稱體積排阻層析 、 分子篩層析 ， 是利用凝膠粒子 (通常稱為凝膠過濾介質 )為固定相 ， 根據料液中溶質相對分子質量的差別進行分離的液相層析法 。 如圖 76所示 ， 在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過濾介質的層析柱中 ， 料液中溶質 1的相對分子質量很大 ， 不能進入到凝膠的細孔中 ， 因而從凝膠間的床層空隙流過 ， 洗脫體積為層析柱的空隙體積；對子溶質 4， 其相對分子質量很小 ，能夠進入到凝膠的所有細孔中 ， 因而其洗脫體積接近柱體積；相對分子質量介于溶質 1和溶質 4之間的溶質 2和 3可進入到凝膠的部分細孔中 ， 故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間 ， 根據相對分子質量的差別 （ 溶質 2的相對分子質量大于溶質 3） 順序洗脫 。 相對分子質量大于溶質 l和小于溶質 4的溶質的洗脫體積分別與溶質 1和溶質 4相同 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 圖 76 GFC的分離原理及洗脫曲線 GFC操作中溶質的分配系數(shù) M只是相對分子質量、分子形狀和凝膠結構 (孔徑分布 )的函數(shù)，與所用洗脫液的 pH值和離子強度等物性無關，即在一般的層析操作條件下、相對分子質量一定的溶質的分配系數(shù)為常數(shù)。因此， GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進行洗脫展開，這種洗脫法稱為恒定洗脫法 (isocratIc elution)。 2． 凝膠層析的操作 （ 1）凝膠的處理 葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠上以干品出售的，所以在使用前必須溶脹。可以將它們浸泡在洗脫劑中，慢慢攪拌。洗脫劑應具有一定的離子強度（約為 ）。 （ 2） 裝柱 裝柱前 ， 柱的底部要先放些玻璃棉 、 玻璃細孔板等可拆卸的支持物 ， 以支持固定相 。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。 床層要均勻 ， 不能有紋路或氣泡 。 裝柱時要考慮凝膠的承壓能力 ， 如壓力太高 ， 凝膠會被擠壓變形而影響流速 。 （ 3）上樣和洗脫 柱床經洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管 輕輕沿柱壁將試樣 加入至 柱的上面，防止擾動填充層表面 ，打開柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內。當樣品液面恰與凝膠床表面平時，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。這一步關鍵是既 要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應的洗脫液。 非水溶性物質的洗脫采用有機溶劑（如苯和丙酮），水溶性物質的洗脫一般采用水或具有不同離子強度和 pH的緩沖液。 PH的影響與被分離物質的酸堿性有關，在酸性 pH時堿性物質易于洗脫，在堿性 pH時酸性物質易于洗脫。多糖類物質的洗脫以水為最佳，有時為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。 （ 4）凝膠的再生和保養(yǎng) 理論上因為凝膠本身不與溶質發(fā)生作用，所以層析分離后無需再生處理，但實際操作時凝膠層常有一定的污染，必須作適當?shù)奶幚怼＝宦?lián)葡萄糖凝膠柱可用 ，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用 NaCl處理。 為了抑制微生物在凝膠層內生長 ， 在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物 ， 將柱真空保存或低溫保存 ， 但溫度不可過低 ， 離子強度要高一些 ， 以防凍結 。 經常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主 ， 只要在其中加入適當?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€月至一年 ， 不需要干燥 。 常用的抑菌劑有：疊氮鈉 （ %） 、 三氯丁醇 （ %～ %） 、 乙基汞硫代水揚酸鈉 (%～ %)、 苯基汞代鹽 （ 包括 、 苯基汞代乙酸鹽 、 硝酸鹽 、 硼酸鹽 ， %～ %） 。 3．凝膠過濾介質 凝膠過濾層析常用于蛋白質等生物大分子的分級分離和除鹽 。 因此 ， 良好凝膠過濾介質應滿足以下要求：
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