生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)(已改無錯(cuò)字)
2023-02-12 15:34:31 本頁(yè)面
【正文】 ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強(qiáng) ， 在較寬的 pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長(zhǎng)； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機(jī)械強(qiáng)度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 商品化的凝膠過濾介質(zhì)除部分機(jī)械強(qiáng)度較高外 ， 大部分為軟凝膠 ， 耐壓能力較低 ， 但均能滿足上述 ① ～ ③ 項(xiàng)的要求 。 其中 Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)之一 ， 目前仍被廣泛使用 。Sephadex G是利用葡聚糖 (右旋糖酐 )交聯(lián)制備的 ， 交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高 ， 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密 ， 吸水量越小 。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小 ， 分 Gl0～ G200共八種型號(hào) 。圖 77為交聯(lián)葡聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖 ， 其中曲線表示葡聚糖凝膠骨架 。 圖 77交聯(lián)葡聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖 78瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu) 瓊脂糖凝膠是另一種較常使用的凝膠過濾介質(zhì)，其骨架結(jié)構(gòu)如圖78所示。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通 Sepharose高。除 GFC外，瓊脂糖凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析的載體。 除上述兩種常用的凝膠外 ， 聚丙烯酰胺凝膠也常使用 。 二 、 凝膠層析的應(yīng)用及特點(diǎn) 1． 分離純化 GFC可用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到 l06數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化 ， 是蛋白質(zhì) 、 肽 、 脂質(zhì) 、 抗生素 、 糖類 、 核酸以及病毒 (50 nm ～ 400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法 。 圖 79是 — 例利用高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。 此外， GFC還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。例如，青霉素的致敏作用 — 般認(rèn)為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強(qiáng)烈致敏性的抗原。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質(zhì)。 圖 79 高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果 2．脫鹽 GFC在生物分離領(lǐng)域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽 ， 以及除去其中的低相對(duì)分于質(zhì)量物質(zhì) 。 例如 ， 經(jīng)過鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高 ， 一般不能直接進(jìn)行離子交換層析分離 ， 可首先用 GFC脫鹽 。 此外 ， GFC還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換 。 生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時(shí)不適合于下一步單元操作的有效實(shí)施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進(jìn)行緩沖液的交換 。 若將緩沖液 A換成緩沖液 B， 可先用 B液沖洗 GFC柱 ， 上樣后用 B液洗脫 ， 即可完成緩沖液的交換 。 3．相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 GFC中溶質(zhì)的分配系數(shù) m在分級(jí)范圍內(nèi)隨相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值增大而線性減小 ， 分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量 Mr之間存在如下關(guān)系： m＝ ablogMr （ 71） 在凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 ， 所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 。 首先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C(12500， 指分子量 ， 下同 )、 肌紅蛋白 (16900)、 胰凝乳蛋白酶 (23200)、 卵白蛋白 (45000)和血紅蛋白 (64500)等分別進(jìn)行凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn) ， 確定分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系式 。然后測(cè)定未知物質(zhì)的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對(duì)分子質(zhì)量 。 不過 ， GFC僅對(duì)球形分子的測(cè)量精度較高 ， 對(duì)分子形狀為棒狀的物質(zhì) ， 測(cè)量值將小于實(shí)際值 。 凝膠層析的特點(diǎn) ①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生 ， 故容易實(shí)施循環(huán)操作 ， 提高產(chǎn)品純度 。 第三節(jié) 離子交換層析 ? 離子交換層析的原理 離子交換層析 (Ion exchange chromatography， IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法 。 離子交換層析的操作 離子交換層析的裝置主要包括蠕動(dòng)泵、離子交換層析柱、紫外檢測(cè)器及部分收集器等。進(jìn)行層析時(shí)，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測(cè)定其含量。 洗脫 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動(dòng)相離子
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