生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-文庫吧資料
2025-01-18 15:34本頁面
【正文】 ， 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密 ， 吸水量越小 。 其中 Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)之一 ， 目前仍被廣泛使用 。 因此 ， 良好凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強(qiáng) ， 在較寬的 pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機(jī)械強(qiáng)度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 常用的抑菌劑有：疊氮鈉 （ %） 、 三氯丁醇 （ %～ %） 、 乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉 (%～ %)、 苯基汞代鹽 （ 包括 、 苯基汞代乙酸鹽 、 硝酸鹽 、 硼酸鹽 ， %～ %） 。 為了抑制微生物在凝膠層內(nèi)生長 ， 在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物 ， 將柱真空保存或低溫保存 ， 但溫度不可過低 ， 離子強(qiáng)度要高一些 ， 以防凍結(jié) 。 （ 4）凝膠的再生和保養(yǎng) 理論上因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生作用，所以層析分離后無需再生處理，但實(shí)際操作時(shí)凝膠層常有一定的污染，必須作適當(dāng)?shù)奶幚怼?PH的影響與被分離物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，在酸性 pH時(shí)堿性物質(zhì)易于洗脫，在堿性 pH時(shí)酸性物質(zhì)易于洗脫。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應(yīng)的洗脫液。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。 裝柱時(shí)要考慮凝膠的承壓能力 ， 如壓力太高 ， 凝膠會被擠壓變形而影響流速 。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。洗脫劑應(yīng)具有一定的離子強(qiáng)度（約為 ）。 2． 凝膠層析的操作 （ 1）凝膠的處理 葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠上以干品出售的，所以在使用前必須溶脹。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 圖 76 GFC的分離原理及洗脫曲線 GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù) M只是相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu) (孔徑分布 )的函數(shù)，與所用洗脫液的 pH值和離子強(qiáng)度等物性無關(guān)，即在一般的層析操作條件下、相對分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù)。 如圖 76所示 ， 在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過濾介質(zhì)的層析柱中 ， 料液中溶質(zhì) 1的相對分子質(zhì)量很大 ， 不能進(jìn)入到凝膠的細(xì)孔中 ， 因而從凝膠間的床層空隙流過 ， 洗脫體積為層析柱的空隙體積；對子溶質(zhì) 4， 其相對分子質(zhì)量很小 ，能夠進(jìn)入到凝膠的所有細(xì)孔中 ， 因而其洗脫體積接近柱體積；相對分子質(zhì)量介于溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4之間的溶質(zhì) 2和 3可進(jìn)入到凝膠的部分細(xì)孔中 ， 故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間 ， 根據(jù)相對分子質(zhì)量的差別 （ 溶質(zhì) 2的相對分子質(zhì)量大于溶質(zhì) 3） 順序洗脫 。 大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法 。 3． 壓力 在以固體 (包括以固體為載體的液體薄層 )為固定相的液相層析中 ， 根據(jù)操作壓力的不同 ， 又分為低壓 (壓力一般小于)、 中壓 (壓力為 ～ 40MPa)和高壓 (壓力為 ～40MPa)液相層析法 。 2．固定相的形狀 根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同 ， 液相層析法又分紙層析法 ( Paper chromatography)、 薄層層析法 ( Thin— 1ayer chromatography)和柱層析法 (Column chromatography)。而固定相有 固體、液體和以固體為載體的液體薄層。 （ 9）色譜流出曲線的意義 色譜峰數(shù)等于樣品中單組分的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值是定性分析的依據(jù)；色譜峰高或面積是定量分析的依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾仁巧V柱分離效能的評價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距是固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的判定依據(jù)。理論塔板數(shù)的多少可反映色譜柱分離性能的優(yōu)劣。 圖 75 分離度影響示意圖 （ 8）柱效 柱效是表達(dá)色譜柱性能的一個(gè)重要參數(shù)，可用 塔板數(shù) N和塔板高度 H表示，其計(jì)算式為： 1 / 25 .5 4 ( )RtN W?LHN? 假設(shè)色譜柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻一致的，混合液流經(jīng)一小段色譜柱后，各組分在兩相間達(dá)平衡。 2121( ) / 2RRttRWW??? 根據(jù)分離度 R的大小可以判斷被物質(zhì)在色譜柱中的分離情況； R值越大，兩色譜峰的距離越遠(yuǎn)，分離效果就越好， 如圖 75所示。 （ 7）分離度 R 是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比值，即： （ 73） 式中 tR tR2—— 分別為組分 1和 2的保留時(shí)間 (也可采用其它保留值 )； W W2—— 分別為組分 1和 2的色譜峰的峰底寬度，與保留值的單位相同。 標(biāo)準(zhǔn)偏差、峰寬與半高峰寬的單位由色譜峰橫坐標(biāo)單位而定，可以是時(shí)間、體積或距離等。 ③ 峰寬 W 自色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)（拐點(diǎn)）處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)，此兩點(diǎn)間的距離稱為峰寬。 ②半高峰寬 W1/2 即 1/2峰高處的峰寬。 （ 6）區(qū)域?qū)挾? 色譜峰的區(qū)域?qū)挾瓤珊饬恐?，并且可與峰高相乘來計(jì)算峰面積，如圖 73所示。
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