生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-資料下載頁
2025-01-12 15:34本頁面
【正文】 強(qiáng)度線性增大的線性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。 ? 在實(shí)際層析操作中，如果料液組成未知，一般應(yīng)首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。溶解樣品的初始緩沖液離子強(qiáng)度要低，層析展開用的洗脫劑離子強(qiáng)度可升高。使用梯度洗脫時(shí)，離子強(qiáng)度逐漸增加。陽離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán) (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 疏水性吸附劑 ? 各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強(qiáng)度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。 ? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸附劑需要再生 ：用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。 影響疏水性吸附的因素 ? 離子強(qiáng)度及種類 ：蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。除離子強(qiáng)度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。高價(jià)陰離子的鹽析作用較大。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。 ? 破壞水化作用的物質(zhì) ： SCN、 CLO4和 I等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用，使疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫 。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 第五節(jié) 親和層析 ? 親和層析的原理 依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動(dòng)相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來，此中分離技術(shù)稱為親和層析。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進(jìn)料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個(gè)步驟 。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強(qiáng)度要適當(dāng)，緩沖液的 pH應(yīng)使配基與目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的靜電作用較小。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。提高流速雖可加快分離速度，但會(huì)降低柱效。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。 ? 清洗操作目的是洗去介質(zhì)顆粒內(nèi)部和顆粒間空隙中的雜質(zhì)，一般使用與吸附時(shí)相同的緩沖液 。 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 ? 洗脫結(jié)束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的 pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性 )的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。 RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)強(qiáng)烈的疏水性。因此，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。 影響因素 ? 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。 ? 流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。因此 RPC多采用降低流動(dòng)相極性 (水含量 )的線性梯度洗脫法。 ? 應(yīng)用 ? RPC主要用于相對(duì)分子質(zhì)量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性有機(jī)溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過程中容易變性失活。 ? 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種物質(zhì)。
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