生化分離技術第七章_層析技術-資料下載頁
2025-01-12 15:34本頁面
【正文】 強度線性增大的線性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內溶質區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質在洗脫過程中得到濃縮。 ? 在實際層析操作中，如果料液組成未知，一般應首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。溶解樣品的初始緩沖液離子強度要低，層析展開用的洗脫劑離子強度可升高。使用梯度洗脫時，離子強度逐漸增加。陽離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團 (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 疏水性吸附劑 ? 各種凝膠過濾介質經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結合。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應的離子；②降低離子強度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。 ? 實驗結束后，吸附劑需要再生 ：用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。吸附劑經(jīng)再生后可反復使用。 影響疏水性吸附的因素 ? 離子強度及種類 ：蛋白質的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大。除離子強度外，離子的種類亦影響蛋白質的疏水性吸附。高價陰離子的鹽析作用較大。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。 ? 破壞水化作用的物質 ： SCN、 CLO4和 I等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用，使疏水性吸附減弱，蛋白質易于洗脫 。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質也具有影響水化的作用，降低蛋白質的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質的疏水部位結合，從而減弱蛋白質的疏水性吸附。 第五節(jié) 親和層析 ? 親和層析的原理 依據(jù)生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理，采用一定技術，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來，此中分離技術稱為親和層析。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進料吸附、清洗、洗脫和介質再生幾個步驟 。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強度要適當，緩沖液的 pH應使配基與目標產(chǎn)物及雜質的靜電作用較小。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。提高流速雖可加快分離速度，但會降低柱效。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。 ? 清洗操作目的是洗去介質顆粒內部和顆粒間空隙中的雜質，一般使用與吸附時相同的緩沖液 。 ? 目標產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 ? 洗脫結束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和結合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結合，洗脫目標產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的 pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標產(chǎn)物的親和吸附作用。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質極性 (疏水性 )的差別進行溶質分離純化的洗脫層析法。 RPC中溶質也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性。因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進行溶質的洗脫分離。 影響因素 ? 溶質在反相介質上的分配系數(shù)取決于溶質的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。 ? 流動相的極性越大，溶質的分配系數(shù)越大。因此 RPC多采用降低流動相極性 (水含量 )的線性梯度洗脫法。 ? 應用 ? RPC主要用于相對分子質量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可用于蛋白質等生物大分子的分析和純化。由于反相介質表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性有機溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過程中容易變性失活。 ? 反相介質性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質。
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