生化分離技術第七章_層析技術-wenkub.com
2025-01-09 15:34 本頁面
【正文】 由于反相介質表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性有機溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過程中容易變性失活。 影響因素 ? 溶質在反相介質上的分配系數(shù)取決于溶質的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的 pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標產(chǎn)物的親和吸附作用。 ? 清洗操作目的是洗去介質顆粒內部和顆粒間空隙中的雜質，一般使用與吸附時相同的緩沖液 。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強度要適當，緩沖液的 pH應使配基與目標產(chǎn)物及雜質的靜電作用較小。 ? 破壞水化作用的物質 ： SCN、 CLO4和 I等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用，使疏水性吸附減弱，蛋白質易于洗脫 。 影響疏水性吸附的因素 ? 離子強度及種類 ：蛋白質的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結合。陽離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 ? 在實際層析操作中，如果料液組成未知，一般應首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。 離子交換層析的操作 離子交換層析的裝置主要包括蠕動泵、離子交換層析柱、紫外檢測器及部分收集器等。 不過 ， GFC僅對球形分子的測量精度較高 ， 對分子形狀為棒狀的物質 ， 測量值將小于實際值 。 若將緩沖液 A換成緩沖液 B， 可先用 B液沖洗 GFC柱 ， 上樣后用 B液洗脫 ， 即可完成緩沖液的交換 。 圖 79 高效 GFC分離骨髓血清蛋白質的結果 2．脫鹽 GFC在生物分離領域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽 ， 以及除去其中的低相對分于質量物質 。 圖 79是 — 例利用高效 GFC分離骨髓血清蛋白質的結果。Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機械強度較普通 Sepharose高。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小 ， 分 Gl0～ G200共八種型號 。 商品化的凝膠過濾介質除部分機械強度較高外 ， 大部分為軟凝膠 ， 耐壓能力較低 ， 但均能滿足上述 ① ～ ③ 項的要求 。 經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主 ， 只要在其中加入適當?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€月至一年 ， 不需要干燥 。多糖類物質的洗脫以水為最佳，有時為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。這一步關鍵是既 要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。 床層要均勻 ， 不能有紋路或氣泡 ?？梢詫⑺鼈兘菰谙疵搫┲校龜嚢?。 相對分子質量大于溶質 l和小于溶質 4的溶質的洗脫體積分別與溶質 1和溶質 4相同 。 高壓液相層析法中層析介質 （ 固定相 ）微細 ， 分離精度高 、 速度快 ， 主要用于成分分析 。生物物質一般存在于水溶液中，因此，生物分離主要采用液相層析法，如固定相為液體的分配層析法，如固定相為固體的吸附層析法及固定相為固定于固體表面的液體薄層（以固體為載體）的分配層析法等。單位長度色譜柱內包含的理論塔板數(shù)越多，流動相通過的塔板數(shù)也越多，說明流動相流過色譜柱的平衡次數(shù)越多，色譜柱的分離效率就越高。當 R1時，兩峰有部分重疊；當 R = 1時，兩峰有 98%的分離；當 R = ，分離程度可達 %；一般用 R = 離的標志。在理想的色譜中，組分的譜帶應是很窄的，若譜帶較寬，將直接導致分離效果下降。它與標準偏差的關系為： W1/2 = 。 222 ,111RRRRtVrtV?????? （ 5）峰高與峰面積 色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高，用 h表示；峰與峰底之間的面積稱為峰面積，用 A表示，可作為定量分析的參數(shù)。保留體積 VR中扣除死體積 V0后，即校正保留體積VR′ ， 將更合理地反映被測組分的保留特點。 ④ 死體積 V0 不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大峰值所需流動相的體積，稱為死體積。保留值可作為定性分析的參數(shù)，由于計量單位的不同，分別稱為保留時間、保留體積。 圖 73 色譜圖 （ 2）色譜峰 當樣品中的組分隨流動相流入檢測器時，檢測器的響應信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線稱為色譜峰，峰的起點和終點的連接直線稱為峰底。色譜圖的縱坐標為檢測器的響應信號；橫坐標為時間 t， 也可用流動相體積 V或距離 L表示。一般情況下 ， 溫度與平衡系數(shù)成反比 ， 各組分平衡系數(shù) K的差異程度決定了色譜分離的效果 ， K值差異越大 ， 色譜分離效果越理想 。在層析柱出口處各個溶質的濃度變化如下圖 72所示。 圖 71柱層析分離設備 1．分離理論基礎 互不混溶的兩相分別稱為固定相 (stationary phase)和流動相 (mobile phase)。第七章 層析技術 第一節(jié) 層析的基本原理及分類 第二節(jié) 凝膠過濾層析 第三節(jié) 離子交換層析 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 第五節(jié) 親和層析 第六節(jié) 反相層析 學習目標 ? 了解層析方法的分類及各種層析方法的應用特點； ? 掌握層析的基本原理及各種層析方法的原理及操作； ? 能利用各種層析技術對生物物質
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