生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)(參考版)
2025-01-15 15:34本頁面
【正文】 ? 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種物質(zhì)。 ? 應(yīng)用 ? RPC主要用于相對分子質(zhì)量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。 ? 流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。因此，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性 )的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進(jìn)料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個(gè)步驟 。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。除離子強(qiáng)度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強(qiáng)度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán) (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。使用梯度洗脫時(shí)，離子強(qiáng)度逐漸增加。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。進(jìn)行層析時(shí)，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。 第三節(jié) 離子交換層析 ? 離子交換層析的原理 離子交換層析 (Ion exchange chromatography， IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法 。 凝膠層析的特點(diǎn) ①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。然后測定未知物質(zhì)的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對分子質(zhì)量 。 3．相對分子質(zhì)量的測定 GFC中溶質(zhì)的分配系數(shù) m在分級范圍內(nèi)隨相對分子質(zhì)量的對數(shù)值增大而線性減小 ， 分配系數(shù)與相對分子質(zhì)量 Mr之間存在如下關(guān)系： m＝ ablogMr （ 71） 在凝膠過濾介質(zhì)的分級范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系 ， 所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定 。 生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時(shí)不適合于下一步單元操作的有效實(shí)施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進(jìn)行緩沖液的交換 。 例如 ， 經(jīng)過鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高 ， 一般不能直接進(jìn)行離子交換層析分離 ， 可首先用 GFC脫鹽 。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質(zhì)。 此外， GFC還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。 二 、 凝膠層析的應(yīng)用及特點(diǎn) 1． 分離純化 GFC可用于相對分子質(zhì)量從幾百到 l06數(shù)量級的物質(zhì)的分離純化 ， 是蛋白質(zhì) 、 肽 、 脂質(zhì) 、 抗生素 、 糖類 、 核酸以及病毒 (50 nm ～ 400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法 。除 GFC外，瓊脂糖凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析的載體。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。圖 77為交聯(lián)葡聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖 ， 其中曲線表示葡聚糖凝膠骨架 。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高
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