【正文】 ?親和吸附劑的保存一般是加入 %的疊氮化鈉， 4℃下保存。這時(shí)需要使用一些比較強(qiáng)烈的處理手段，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當(dāng)?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌浮? 親和吸附劑的再生和保存 ?通常使用過的親和層析柱，用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。 5) 2,4,6三硝基苯磺酸鈉（ TNBS）分析：利用 TNBS與未結(jié)合配體和結(jié)合某些配體的基質(zhì)作用呈現(xiàn)不同的顏色，可以計(jì)算出配體結(jié)合量 6) 元素分析：如果配體中含有某種特別的元素，通過元素分析就可以確定配體結(jié)合量。 3) 凝膠溶解：通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛z溶解，如 75℃下與酸或堿作用，而后直接用光譜法測(cè)量。當(dāng)配體可以用光譜法準(zhǔn)確定量時(shí)，這種方法還是相當(dāng)準(zhǔn)確的。 配體結(jié)合量通常是用每毫升或每克基質(zhì)結(jié)合的配體的量來表示。例如對(duì)于能結(jié)合氨基的活性基團(tuán)，常用的方法是用 2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。 ?配體和基質(zhì)偶聯(lián)完畢后，必須要反復(fù)洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。 配體與基質(zhì)的偶聯(lián) ?基質(zhì)活化后的活性基團(tuán)可以在較溫和的條件下與含氨基、羧基醛基、酮基、羥基、硫醇基等多種配體反應(yīng)，使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。 ?通用性配體通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。 ?對(duì)于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，一般首先使用通用性的配體。 ① 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。 ?完全滿足上述條件的配體實(shí)際上很難找到，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體的條件來選擇盡量滿足上述條件的最適宜的配體。 ③ 配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合 ?實(shí)驗(yàn)過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對(duì)其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分。 ?親和力太強(qiáng)，待分離物質(zhì)很難與配體分離，這又會(huì)造成洗脫的困難。 配體的性質(zhì)與分類 配體的性質(zhì) ① 配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力 ?親和力太弱，待分離物質(zhì)不易與配體結(jié)合，造成親和層析吸附效率很低。 ?引入間隔臂的基質(zhì)與配體結(jié)合時(shí)，配體就可以離開基質(zhì)一定的空間，從而可以減少空間位阻效應(yīng)，易于與待分離物質(zhì)結(jié)合。二者的末端分別為氨基或羧基，通過碳二亞胺的縮合作用可以分別與含羧基或氨基的配體偶聯(lián)。 ?引入間隔臂分子常用的方法是將適當(dāng)長(zhǎng)度的氨基化合物 NH2 (CH2)n R共價(jià)結(jié)合到活化的基質(zhì)上，R通常是氨基或羧基， n一般為 2~12。 間隔臂分子 ?當(dāng)配體較小或待分離的生物大分子較大時(shí)，由于空間障礙，影響待分離的生物大分子與配體的結(jié)合，造成吸附量的降低。 ?另外在偶聯(lián)蛋白質(zhì)配體時(shí)也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝膠。 聚丙烯酰胺的活化 ?聚丙烯酰胺凝膠有大量的甲酰胺基，可以通過對(duì)甲酰胺基的修飾而對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行活化。這樣的條件對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用。 ?活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙基，可以結(jié)合含有伯氨基（ NH2）、羥基（ OH）和硫醇基（ SH）等基團(tuán)的配體。 ?缺點(diǎn)三：溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。 ?缺點(diǎn)一：溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的 pKa＝ ，所以通常會(huì)帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。 ?溴化氰活化的基質(zhì)可以在溫和的條件下與配體結(jié)合，結(jié)合的配體量大。瓊脂糖通常含有大量的羥基，通過一定的處理可以引入各種適宜的活性基團(tuán)。 基質(zhì)的活化 基質(zhì)的活化后才能與配體偶聯(lián)。但它可利用的活性基團(tuán)較少，對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子也有較強(qiáng)的吸附作用。 ② 交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學(xué)穩(wěn)定性較好，但它們的孔徑相對(duì)比較小，而且孔徑的穩(wěn)定性不好，可能會(huì)在與配體偶聯(lián)時(shí)有較大的降低，不利待分離物與配體充分結(jié)合，只有大孔徑型號(hào)凝膠可以用于親和層析。基質(zhì)應(yīng)具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質(zhì)，以使待分離物有充分的空間與配體結(jié)合。以使被分離的生物分子能夠均勻、穩(wěn)定的通透，并充分與配體結(jié)合。親和層析的基質(zhì)應(yīng)具有較多的化學(xué)活性基團(tuán)，通過一定的化學(xué)處理能夠與配體穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，并且結(jié)合后不改變基質(zhì)和配體的基本性質(zhì)。在與配體偶聯(lián)、層析過程中配體與待分離物結(jié)合、以及洗脫時(shí)的 pH、離子強(qiáng)度等條件下，基質(zhì)的性質(zhì)都沒有明顯的改變。 親和吸附劑 選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關(guān)鍵步驟之一。 ?而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動(dòng)相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。 ?親和層析時(shí)首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質(zhì)作為配體，例如分離酶可以選擇其底物類似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑為配體，分離抗體可以選擇抗原作為配體等。 ?親和層析的分離原理簡(jiǎn)單的說就是通過將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。 ?它還用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究。 ?上世紀(jì) 60年代末，溴化氰活化多糖凝膠并偶聯(lián)蛋白質(zhì)技術(shù)的出現(xiàn)，解決了配體固定化的問題，使得親和層析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。 ?使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。 分離純化生物大分子物質(zhì) ?離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。 ?逐步提高洗脫液的離子強(qiáng)度和 pH，各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進(jìn)行分離鑒定。 ?例如，對(duì)氨基酸的分析，使用強(qiáng)酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在 pH 2~3上柱。 ?離子交換劑使用一段時(shí)間后可以通過再生處理重復(fù)使用。 ?先將水依次通過 H+ 型強(qiáng)陽離子交換劑，去除各種陽離子及與陽離子交換劑吸附的雜質(zhì)；然后通過OH 型強(qiáng)陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質(zhì)，即可得到純水。 離子交換層析的應(yīng)用 水處理 分離純化小分子物質(zhì) 分離純化生物大分子物質(zhì) 水處理 ?離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。 樣品的濃縮、脫鹽 ?離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。 ?一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進(jìn)行洗脫。 ?由于 pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 ?改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來。 上樣 ?離子交換層析的上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和 pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1－ 5％為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。 ?平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。 平衡緩沖液 ?平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和 pH的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì) (如蛋白質(zhì) )的穩(wěn)定。 ?直徑和柱長(zhǎng)比一般為 1:10到 1:50之間，層析柱安裝要垂直。 ?離子交換劑保存時(shí)應(yīng)首先處理洗凈蛋白等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎话慵尤?%的疊氮鈉，4℃ 下保存。 ?如，制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是 H或 OH離子（其它離子都會(huì)對(duì)純水有污染）。 ?如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過強(qiáng)，會(huì)造成組分離子難以與交換劑結(jié)合而使交換容量降低。如對(duì)陰離子交換劑用 HCl處理可將其轉(zhuǎn)為 Cl型，用 NaOH處理可轉(zhuǎn)為 OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等。酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。 ?另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會(huì)影響分離效果。常用的酸是 HCl，堿是 NaOH或再加一定的 NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為 Na型，陰離子交換劑為 Cl型。 ?處理時(shí)應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。 ?而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（ mesh）或者顆粒直徑（ mm）來表示，目數(shù)越大表示直徑越小。 ?離子交換劑基質(zhì)的選擇。 ?對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用 NaCl充分置換出 H+，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的 NaOH滴定生成的 HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量； ?對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將 H+充分置換出來，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。 ?陽離子交換劑首先用 HCl處理，使其平衡離子為H+。 ?離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)表示。 ?pH還影響樣品組分的帶電性。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。 ?另一些影響因素如實(shí)驗(yàn)中的離子強(qiáng)度、 pH值等，主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。 ?樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。 影響交換容量的因素主要可以分為兩個(gè)方面： ?一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。 ?通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。 ?一般來講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì) OH離子的結(jié)合力比 Cl離子小，弱堿型離子交換劑對(duì) OH離子的結(jié)合力比 Cl離子大。 ?一般結(jié)合季胺基團(tuán)（ N(CH3)3），如季胺乙基（ QAE）為強(qiáng)堿型離子交換劑。 ?陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。 ?結(jié)合磷酸基團(tuán)（ PO3H2）和亞磷酸基團(tuán)（ PO2H）為中等酸型離子交換劑。 ?強(qiáng)酸型離子交換劑在較大的 pH范圍內(nèi)電荷基團(tuán)完全解離 ?弱酸型完全解離的 pH范圍則較小，如羧甲基在 pH小于 6時(shí)就失去了交換能力。 ?陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，可以交換陽離子物質(zhì)。 ?以纖維素（ Cellulose）、球狀纖維素（ Sephacel）、葡聚糖（ Sephadex）、瓊脂糖（ Sepharose）為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。 ?例如，陽離子交換劑分離蛋白質(zhì) ? 在一定的 pH條件下， pH pI 時(shí)，蛋白帶負(fù)電，不能與陽離子交換劑結(jié)合； pH pI時(shí)，蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般 pI越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。如陽離子交換劑對(duì)離子的結(jié)合力順序?yàn)椋?Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ ； Na+ Ca2+ Al3+ Ti4+ 。 ?離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、 pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。 ?各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的過程。 ?平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱陽離子交換劑。 ?電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。 ?固定相是離子交換劑，由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。 ?50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。 ?1848年， Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。 ?通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液?；静桓淖?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和pH值。 ?例如對(duì)于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質(zhì)，凝膠層析是一種簡(jiǎn)單而有效的方法。 凝膠層析的應(yīng)用 生物大分子的純化 分子量測(cè)定 脫鹽及去除小分子雜質(zhì) 去熱源物質(zhì) 溶液的濃縮 去熱源物質(zhì) ?熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)。 ?洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng)。 ?洗脫速度取決于很多因素，包括柱長(zhǎng)、凝膠種類、顆粒大小等。 洗脫速度 ?一般洗脫速度要恒定而且合適。 ?加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。 加樣量 ?加樣要盡量快速、均勻。 ?一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。 ?有時(shí)為了防止新凝膠柱對(duì)樣品的吸附，可以用一些物質(zhì)預(yù)先過柱，以消除吸附。 ? 如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用。 凝膠柱的鑒定 ?柱填裝后肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡。 ?層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在 1:25~1:100之間。 ?一般來講，主要是層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長(zhǎng)度不能過長(zhǎng)