【正文】 （ 1） SDSPAGE 的原理 蛋白質(zhì)分子的解聚 SDS 是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破 壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、β 巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，凝膠的分子篩效應(yīng)（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。因此， pH 應(yīng)限制在 3~10 之間。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時，在電 泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的 電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。 （ 2）機(jī)械強(qiáng)度高：可以在濃度 1%以下使用； （ 3）無毒； （ 4）染色、脫色程序簡單，背景色較低； （ 5）熱可逆性； （ 6）生物中性：一般不與生物材料結(jié)合； （ 7）電內(nèi)滲（ EEO）大：對于對流電泳有益 1電泳系統(tǒng)的基本組成 （ 1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽 （ 2）電源 :聚丙烯酰胺凝膠電泳 200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳 1000~2020V，固相梯度等電聚焦 3000~8000V （ 3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng) :高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻； （ 4）凝膠干燥器 :用于電泳和染色后的干燥； （ 5）灌膠模具：制膠， 玻璃板和梳子； （ 6）電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如 PVDF 膜 （ 7）電泳洗脫儀：回收樣品 （ 8）凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié)果。 （ 2）系統(tǒng) pH 值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳 pH 值，以獲得最佳的聚合結(jié)果； （ 3）溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性； （ 4）分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣 （ 5）系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合； 聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng) 在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電 泳介質(zhì)具有高粘度和高的 摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴(kuò)散減到最小。 該引發(fā) 增速的催化系統(tǒng)實質(zhì)是自由基催化的氧化 還原過程。 區(qū)帶電泳的主要技術(shù) 具有支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳具有防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，可使被分離的成分得到最大分辨率的分離； Etdm ?? 區(qū)帶電泳中的常用技術(shù) 載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳 無載體電泳：自由電泳、毛細(xì)管電泳 凝膠電泳 作為電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。sec1 電泳遷移率 電泳遷移率（ mobility） :在電位梯度 E 的影響下，帶電顆粒在時間 t 中的遷移距離 d。 電泳的原理 蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的 H+濃度或與其它大分子的相互作用。 atmp ppp ?? 0atmp ppp ??? 0)( ?apLJ pw ??? 二、電泳 技術(shù) 電泳概念 Arne Tiselius——物理化學(xué)家、諾貝爾獎金獲得者 定義 ——荷電的膠體粒子在電場中的移動； 電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴(kuò)散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強(qiáng)度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，操作壓力比超濾大得多。 當(dāng) ??? 01 PP 時，水將從溶液一側(cè)向純水一側(cè)移動，此種滲透稱之為反滲透。 溶液中水的化學(xué)勢 因此，通常情況下， ???o 其結(jié)果是水從純水一側(cè)透過半透膜向溶液側(cè)滲透，使后者的液位抬高。 滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度； 一般說來，無機(jī)小分子的滲透壓要比有機(jī)大分子溶質(zhì)的滲透壓高得多。 膜分離技術(shù)的類型和定義 膜分離過程的實質(zhì)是物質(zhì)透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的，故而可以按分離粒子大小進(jìn)行分類： （ 1）微濾：以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力為推動力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，孔徑分布范圍在 ~14μ m之間； （ 2）超濾：分離介質(zhì)同上，但孔徑更小，為 ~ μ m，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)； （ 3）反滲透：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在 ~ μ m 之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）； （ 4）納濾：以壓力差為推動力，從溶液中分離 300~1000 小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均 2nm； （ 5）電滲析：以電位差為推動力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質(zhì)的膜分離操作； 膜的分類 ?按孔徑大?。何V膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜 ?按膜結(jié)構(gòu)：對稱性膜、不對稱膜、復(fù)合膜 ?按材料分：合成有機(jī)聚合物膜、無機(jī)材料膜 膜材料的特性 對于不同種類的膜都有一個基本要求： （ 1）耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在 ~，反滲透膜的壓力更高，約為 1~10MPa （ 2）耐高溫 :高通量帶來的溫度升高和清洗的需要 （ 3）耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解； （ 4）化學(xué)相容性：保持膜的穩(wěn)定性； （ 5）生物相容性：防止生物大分子的變性； （ 6）成本低； 各種膜材料 （ 1）有機(jī)高分子膜： 纖維素酯 膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯； （ 2）無機(jī)多孔膜：陶瓷膜 膜組件 （ 1）管式 （ 2）中空纖維 （ 3）螺旋卷繞式 （ 4）平板式 共同的特點 （ 1）盡可能大的膜表面積 （ 2）可靠的支撐裝置 （ 3）可引出透過液 （ 4）膜表面濃度差極化達(dá)到最小 超濾和反滲透 目的：將溶質(zhì)通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來 分離時的推動力都是壓強(qiáng)，由于被分離物質(zhì)的分子量和直徑大小差別及膜孔結(jié)構(gòu)不同，其采用的壓強(qiáng)大小不同。 膜的概念 （ 1）在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄 層物質(zhì)稱為膜。 特點： 由于在等電點附近，溶質(zhì)仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用 操作時的注意事項： （ 1）由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點通常會發(fā)生 “漂移 ”， 陽 高，陰 低 （ 2）溶質(zhì)的穩(wěn)定性 （ 3）鹽析效應(yīng) 八、其它沉淀法 （ 1） 水溶性非離子型聚合物沉淀劑 PEG（聚乙二醇） 、 NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯 常用的此類沉淀劑是 PEG，相對分子量一般為 6000； （ 2） 成鹽類復(fù)合 物沉析劑 A. 金屬復(fù)合鹽：與生物分子的酸性基團(tuán)作用， Cu2＋ 、 Ag＋ 、 Zn2＋ B. 有機(jī)酸復(fù)合鹽：與生物分子的堿性基團(tuán)作用 C. 無機(jī)復(fù)合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽 （ 3） 離子型表面活性劑 CTAB（十六烷基三甲基季銨鹽溴化物）、十二烷基磺酸鈉（ SDS） （ 4） 離子型多聚物沉析劑 核酸（多聚陰離子）、魚精蛋白（多聚陽離子） （ 5） 氨基酸類沉析劑 一類選擇性沉淀劑。（ pI） （ 4）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低有利于沉析， ~（ 5）樣品濃度： ~2% ?。喝軇┯昧看?，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低 （ 6）金屬離子的助沉析作用： Zn2+、 Ca2+ 七、等電點沉淀法 概念： 調(diào)節(jié)體系 pH 值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。 （ 2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。 鹽析用鹽的選擇 在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為： 半徑小的高價離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱 IKS s?? ?log221 iiZcI ?? （ Ks）磷酸鉀 硫酸鈉 硫酸銨 檸檬酸鈉 硫酸鎂 選用鹽析用鹽的幾點考慮： （ 1）鹽析作用要強(qiáng) （ 2）鹽析用鹽需有較大的溶解度 （ 3）鹽析用鹽必須是惰性的 （ 4）來源豐富、經(jīng)濟(jì) 常用的鹽析用鹽 硫酸銨：溶解度大（ 767g/L） 硫酸鈉 磷酸鹽 檸檬酸鹽 影響鹽析的因素 （ 1）溶質(zhì)種類的影響： Ks 和β值 （ 2）溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低； （ 3）蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高； （ 4） pH 值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系 pH 值，使其在 pI 附近； （ 5）鹽析溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降； 鹽析用鹽的用量選擇 飽和度的概念： 以硫酸銨為例： 25oC 時，硫酸銨的飽和溶 解度是 767g/L，定義為 100%飽和度 六、有機(jī)溶劑沉淀 概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。 Ks 鹽析法 ：在一定 pH 和溫度下，改變體系離子強(qiáng)度進(jìn)行鹽析的方法； β鹽析法 ：在一定離子強(qiáng)度下，改變 pH 和溫度進(jìn)行鹽析； 其中， Ks 鹽析法由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。 I—離子強(qiáng)度 c:離子濃度； Z：離子化合價 β —鹽濃度為 0 時，蛋白質(zhì)溶解度的對數(shù)值。 二、沉析的特點 操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高，但針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng) 三、分類 鹽析、有機(jī)溶劑沉析、等電點沉析等 四、沉析操作的一般過程 在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑； 沉淀物的陳化，促進(jìn)晶體生長； 離心或過濾，收集沉淀物； 五、鹽析 (Salt induced precipitation) 概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液 中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。 A 280 0.0 九、親和色譜（ Affinity chromatography） 所謂親和色譜就是將親和技術(shù)和色譜技術(shù)集成得到的一種高效分離手段，其原理與親和吸附基本類似，所不同的是經(jīng)過修飾的載體顆粒是填充在色譜柱中，以實現(xiàn)連續(xù)的色譜分離 載體活化、配基連接、吸附、洗脫 十、蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法 免疫親和層析 屬于吸附色譜 中的一種，利用抗原 抗體作用的高度專一性以及較強(qiáng)的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離 免疫親和層析介質(zhì)的獲得： （ 1）獲得抗體 （ 2）抗體連接到載體上 疏水層析 在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團(tuán)，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團(tuán)相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。 同樣分為 Q 系列和 P 系列 七、分子篩凝膠色譜（ Gel Peration Chromatography, GPC） 概念：在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離 特點： 操作簡便 分離效果好，重復(fù)性高，回收率高 分離條件溫和 應(yīng)用廣泛 適用于生物大分子的初級分離，脫鹽 分辨率低 分子篩凝膠色譜原理 不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng) GPC 柱時，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以 進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時間短；而小分子恰恰相反，保留時間較長）而得以分離（如上圖所示） 八、疏水作用層析（ Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 原理：依據(jù)生物大分子疏水性差異實現(xiàn)分離 由于不同蛋白質(zhì)分子氨基酸組成差異，其疏水性也不盡相同，HIC 技術(shù)是基于生物大分子的疏水性差異而實現(xiàn)分離的，該方法彌補(bǔ)了 HPLC 難以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離的不足。其優(yōu)點是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論 二、色譜分離方法的分類 色譜分離方法很多，種類有四、五十種。 生化分離技術(shù) 生化系生物學(xué)教研室 授課內(nèi)容 第七講 色譜技術(shù) 授課時間 2 學(xué)時 教學(xué)目的 通過本章學(xué)習(xí)應(yīng)掌握的問題 什么是色譜分離技術(shù)？ 色譜分離技術(shù)的分類？ 什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計算理論塔板數(shù)？ 什么是吸附色譜及其分類和基本原理？ 什么是分配色譜？ 離