【正文】 ? 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分從 進(jìn)料位置開始在環(huán)狀床層內(nèi) 形成螺旋形譜帶。 ? 環(huán)狀床層繞中心軸以每分鐘 ～ 中，洗脫液和料液被連續(xù)地 從床層的頂端輸入。 ? CAC過(guò)程的關(guān)鍵是一個(gè)連續(xù)加料柱，由 Fox等開發(fā)而成。 連續(xù)環(huán)狀色譜分離法 ? 連續(xù)環(huán)狀色譜分離 （ continuous annular chromatography， 簡(jiǎn)寫 CAC） 技術(shù)就是 80年代以來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種連續(xù)色層分離過(guò)程。 ? 徑向色譜柱在生物制劑、血液制品及基因工程產(chǎn)品等方面已廣泛使用，其結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)的軸向色譜柱。 ? 當(dāng)保持制備色譜柱直徑不變，只增加柱長(zhǎng)時(shí)，可以線性增大樣品處理量，樣品的規(guī)?？稍诒３窒嗨频纳V條件下直接放大。 ? 該技術(shù)的樣品回收率高，分辨率高，既適用于微量分析也可用于大規(guī)模制備。因此需要在具有濃縮作用的單元操作 （ 如超濾、離子交換和親和色譜等 ） 后使用。 ? GFC的具體優(yōu)點(diǎn)如下： ① 溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批分離操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度； ③ 作為脫鹽手段， GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高； ④ 分離機(jī)理簡(jiǎn)單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。 ③相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 ? 在凝膠過(guò)濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成正比，所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。右圖是一例利 用高效 GFC分離骨髓 血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。 ? 對(duì)于商品化的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，廠商的產(chǎn)品目錄中一般均給出其凝膠的各種性質(zhì)，如分級(jí)范圍、粒徑、流速與壓力的關(guān)系等，可參考使用。 ⑥ 空隙體積 （ void volume） ? 指色譜柱中凝膠之間空隙的體積，即 V0值。 ⑤ 床體積 （ bed volume） ? 即 1 g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。m ， 甚至 6～ 10 181。 例如，Sepharose和 Sephadex凝膠粒徑分布為 45～165 181。m（ 100～ 200目 ） ，硬凝膠粒徑較小，一般為 5～ 50 181。凝膠粒徑多用篩目或微米表示。 ④ 凝膠粒徑 ? 凝膠一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要影響。 Sephadex G50的分級(jí)范圍為 ～ 30 kD。例如 Sephadex G50的排阻極限是 30 kD， 即相對(duì)分子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，其洗脫體積為 V0。 ⑩ TSK gel SW ? 硅膠。 ⑨ TSK gel PW ? 為親水性聚乙烯。 ③ 聚丙烯酰胺系（ BioGel P） ④ Sephacryl ? 為丙烯基葡聚糖與 N,N’’亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物。 Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通 Sepharose高。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小，分 G 10～ G 200共八種型號(hào)。 2. 商品化的凝膠過(guò)濾介質(zhì)種類 ① 葡聚糖系 ? 其中 Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過(guò)濾介質(zhì)之一，目前仍被廣泛使用。 凝膠過(guò)濾色譜 ? 原理與操作 ? GFC利用凝膠為固定相，根據(jù)中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相色譜法。 ? 除硅膠外，高分子聚合物也可作為反相介質(zhì)的載體，如 TSK gel Octadecyl4PW和 TSK gel OctadecylNPR（聚丙烯酸酯 C18）等。 ? 反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中最具代表性的是以硅膠為載體，通過(guò)硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非極性分子層制備。流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。 ? 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。分配柱色譜法中所用的載體主要有三類： ①硅膠 ②硅藻土 ③纖維素 ? RPC主要用于分子量低于 5000，特別是 1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。 分配色譜 ? 分配色譜法是靠溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法。 ? IEC的應(yīng)用 ? 特點(diǎn) ? 歸納而言， IEC具有如下的特點(diǎn)； ①料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作； ②應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短； ③產(chǎn)品回收率高； ④商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。 ? 常用于制備離子交換劑的介質(zhì)有纖維素類、葡聚糖系（ Sephadex）、瓊脂糖系（ Sepharose、 BioGel A ）、聚乙烯醇系（ Toyopearl）和苯乙烯系（ TSK gel PW）等。 ? 用于蛋白質(zhì)等生物分子離子交換的陰離子交換基有 DEAE（二乙胺乙基，適用范圍： pH＜ ） ， QAE（季銨乙基）。 ? 一方面蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對(duì)離子強(qiáng)度非常敏感，即離子強(qiáng)度的微小改變，就會(huì)引起分配系數(shù)的很大變化；另一方面，不同蛋白質(zhì)的 B值可能相差很大。 ? B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子交換基的離子價(jià)數(shù)之比。荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示： m（ I）＝ A／ IB＋ m∞ ? 其中 I為流動(dòng)相的離子強(qiáng)度， A和 B為常數(shù)， m∞為離子強(qiáng)度無(wú)限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。但是共價(jià)結(jié)合具有特異性，牢固并且在適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件下還可獲得較高的收率和純度，故這種方法在某些領(lǐng)域中，特別是在蛋白質(zhì)序列分析過(guò)程及其結(jié)構(gòu)研究中，有著特殊的作用，甚至還可能成為最方便快速、簡(jiǎn)單的方法而受到歡迎。對(duì)于還原型的巰基丙基瓊脂糖還必須在 80℃ 下回流 3小時(shí)。 ? 洗脫時(shí)，釋出的吡啶 2硫酮是一個(gè)發(fā)色化合物，在 343 nm處檢出。 ②洗脫 ? 洗脫可以用 L半胱氨酸，巰基乙醇，谷胱甘肽，以及二硫蘇糖醇等巰基化合物，在中性條件下進(jìn)行。 ? 共價(jià)作用色譜分離法的操作過(guò)程： ①吸附 ? 蛋白質(zhì)中的半胱氨酸基，與色譜填料上的二硫鍵發(fā)生共價(jià)交換反應(yīng)，蛋白質(zhì)被結(jié)合到色譜填料上。 ? 凝膠也可通過(guò)環(huán)氧氯丙烷活化后，再用硫代硫酸鹽處理，得到還原型的巰基丙基型凝膠，最后用 2,2’吡啶基二硫化合物活化便得到巰基丙基型的二硫健色譜填料。 ? 首先要制備色譜填料。 共價(jià)作用色譜 ? 共價(jià)作用色層分離法是根據(jù)巰基化合物與色譜填料上二硫鍵之間的共價(jià)化學(xué)反應(yīng)面進(jìn)行的色譜分離的方法。 ? 金屬螯合色譜主要用于要依賴金屬或直接與金屬作用的蛋白質(zhì)、肽類、核苷酸、核酸及酶的分離與純化。 ? 在中性條件下，金屬螯合色譜填料能與蛋白質(zhì)外露的組氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巰基結(jié)合，交換配基。 ? Cu2+， Ni2+， Zn2+和 Co2+等過(guò)渡金屬離子可與 N、 S和 O等供電原子（ electron donor atom）產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（ His）的咪唑基、半胱氨酸（ Cys）的巰基和色氨酸（ Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以 His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。據(jù)推測(cè)，發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是該酶與苯環(huán)之間可產(chǎn)生 ππ健。 ? HIC分離蛋白質(zhì) ? HIC的特點(diǎn) ? HIC可作為 IEC的補(bǔ)充工具。 ④溫度 ? 疏水性吸附與一般吸附相反。 ③表面活性劑 ? 表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。 ②破壞水化作用的物質(zhì) ? SCN－ ， CIO4－ 和 I－ 等半徑較大、電荷密度低的陰離子具有減弱水分子之間相互作用。在高價(jià)陰離子的存在下，疏水性吸附作用力較高。mol/cm3之間。所以，蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動(dòng)相離子強(qiáng)度的提高而增大。 疏水作用色譜 ? 疏水作用色譜 （ hydrophobic interaction chromatography， HIC）是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的一種色譜法。 ? HAP吸附劑價(jià)格便宜，遠(yuǎn)低于離子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過(guò)程，已成為單克隆抗體的主要純化手段。