【正文】 于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性有機(jī)溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活。 ? 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。當(dāng)固定相一定時(shí)，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。因此 RPC多采用降低流動(dòng)相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。 ? 反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非極性分子層制備。其中利用 C18硅烷化試劑制備的反相介質(zhì)最多，通稱 ODS（ Octadecyl silica），其次是 C8和 C4。 ? 除硅膠外，高分子聚合物也可作為反相介質(zhì)的載體，如 TSK gel Octadecyl4PW和 TSK gel OctadecylNPR（聚丙烯酸酯 C18）等。 ? 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離肽、氨基酸、核酸、甾類、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種物質(zhì)。 凝膠過濾色譜 ? 原理與操作 ? GFC利用凝膠為固定相，根據(jù)中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相色譜法。 ? 凝膠過濾介質(zhì) 1. 對(duì)凝膠過濾介質(zhì)的要求 ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強(qiáng) ， 在較寬的 pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長 ， ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力 （ 流速 ） 。 2. 商品化的凝膠過濾介質(zhì)種類 ① 葡聚糖系 ? 其中 Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)之一，目前仍被廣泛使用。 Sephadex G是利用葡聚糖 （ 右旋糖酐 ） 交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小，分 G 10～ G 200共八種型號(hào)。 ② 瓊脂糖系（ Sepharose、 BioGel A ） ? 瓊脂糖凝膠 Sepharose是另一種較常使用的凝膠過濾介質(zhì)，機(jī)械強(qiáng)度較低。 Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通 Sepharose高。 ? BioGel A為 Bio Rad產(chǎn)品。 ③ 聚丙烯酰胺系（ BioGel P） ④ Sephacryl ? 為丙烯基葡聚糖與 N,N’’亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物。 ⑤ Superdex ⑥ Superose ⑦ TSK gel Toyopearl HW ? 聚乙烯醇系 ⑧ Biobeads ? 為苯乙烯與二乙烯苯的共聚物、用于非水體系。 ⑨ TSK gel PW ? 為親水性聚乙烯。 PW系列機(jī)械強(qiáng)度更高，適用于高壓液相色譜。 ⑩ TSK gel SW ? 硅膠。 ? 凝膠特性參數(shù) ① 排阻極限 （ exclusion limit） ? 凝膠過濾介質(zhì)的排阻極限是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。例如 Sephadex G50的排阻極限是 30 kD， 即相對(duì)分子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，其洗脫體積為 V0。 ② 分級(jí)范圍 （ fractionation range） ? 即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。 Sephadex G50的分級(jí)范圍為 ～ 30 kD。 ③ 溶脹率 ? 溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)，Sephadex G50的溶脹率為 500％土 30％。 ④ 凝膠粒徑 ? 凝膠一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要影響。粒徑越小， HETP越小，分離效率越高。凝膠粒徑多用篩目或微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為 50～ 150 181。m（ 100～ 200目 ） ，硬凝膠粒徑較小，一般為 5～ 50 181。m 。 例如，Sepharose和 Sephadex凝膠粒徑分布為 45～165 181。m ， 而 Superose和 TSK Toyopearl HW系列可小到 20～ 40 181。m ， 甚至 6～ 10 181。m 。 ⑤ 床體積 （ bed volume） ? 即 1 g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。Sephadex G50的床體積為 9～ 11 cm3/g干膠。 ⑥ 空隙體積 （ void volume） ? 指色譜柱中凝膠之間空隙的體積，即 V0值。空隙體積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定，一般使用平均相對(duì)分子質(zhì)量為 2021 kD的水溶性藍(lán)色葡聚糖 （ blue dextran） 。 ? 對(duì)于商品化的凝膠過濾介質(zhì)，廠商的產(chǎn)品目錄中一般均給出其凝膠的各種性質(zhì)，如分級(jí)范圍、粒徑、流速與壓力的關(guān)系等，可參考使用。 ? 分配系數(shù) Kd＝ （ Ve－ Vo） /Vi 0≤ Kd≤1 ? MW與 Kd的關(guān)系 Kd ＝ a－ blogMW ? GFC的應(yīng)用及特點(diǎn) ① 分離純化 ? GFC可用于相對(duì)分子 質(zhì)量從幾百到， 106 數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離 純化。右圖是一例利 用高效 GFC分離骨髓 血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。 色譜柱： 10 300， Superose 6 洗脫液： ／ L磷酸鹽 ＋ ／ L NaCl（ ） 流量： ／ min 2. IgA二聚體 ②脫鹽 ? GFC在生物分離領(lǐng)域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽，以及除去其中的低相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。 ③相對(duì)分子質(zhì)量的測定 ? 在凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成正比，所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測定。 ? 不過， GFC僅對(duì)球形分子的測量精度較高，對(duì)分子形狀為棒狀的物質(zhì)，測量值將小于實(shí)際值。 ? GFC的具體優(yōu)點(diǎn)如下： ① 溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批分離操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度； ③ 作為脫鹽手段， GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高； ④ 分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。 ? 與其他色譜法相比， GFC的不足之處在于： ① 僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進(jìn)行分離，選擇性低，料液處理量小； ② 經(jīng) GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作 （ 如超濾、離子交換和親和色譜等 ） 后使用。 高速逆流色譜 ? 高速逆流色譜（ High speed counter current chromatography， HSCCC）是一種無固相載體的連續(xù)液液分配色譜技術(shù)，在重力與離心力場的作用下，其固定相被保留于分離柱內(nèi)，從而避免了固相載體與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)變性或不可逆吸附。 ? 該技術(shù)的樣品回收率高，分辨率高，既適用于微量分析也可用于大規(guī)模制備。 TBE 300V型高速逆流色譜示意圖 徑向色譜分離法 ? 徑向色譜柱的結(jié)構(gòu)及原理如圖所示。 ? 當(dāng)保持制備色譜柱直徑不變，只增加柱長時(shí)，可以線性增大樣品處理量，樣品的規(guī)?？稍诒３窒嗨频纳V條件下直接放大。 ? 由于徑向色譜柱反壓降較低 ， 樣品出峰較快 ，對(duì)設(shè)備的要求較低 ， 通常的低壓色譜系統(tǒng)就可滿足要求 。 ? 徑向色譜柱在生物制劑、血液制品及基因工程產(chǎn)品等方面已廣泛使用，其結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)的軸向色譜柱。 ? 當(dāng)色譜柱體積相差不大時(shí) （ 徑向柱大 25％ ） ，徑向柱的流速為軸向柱的 3～ ，處理量為軸向柱的 3倍。 連續(xù)環(huán)狀色譜分離法 ? 連續(xù)環(huán)狀色譜分離 （ continuous annular chromatography， 簡寫 CAC） 技術(shù)就是 80年代以來迅速發(fā)展起來的一種連續(xù)色層分離過程。它能夠分離多組分混合物并且設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單、操作方便，故很有工業(yè)應(yīng)用前景。 ? CAC過程的關(guān)鍵是一個(gè)連續(xù)加料柱，由 Fox等開發(fā)而成。連續(xù)加料柱由兩個(gè)同心圓筒緊夾在底板上而組成，兩同心圓筒間的間距為 1cm，空間內(nèi)用適當(dāng)?shù)臉渲蚰z膠充填，在圓柱間隙下的底盤四周有一系列小孔通向接收器。 ? 環(huán)狀床層繞中心軸以每分鐘 ～ 中，洗脫液和料液被連續(xù)地 從床層的頂端輸入。洗脫液 沿圓周方向，連續(xù)向下沖洗， 而待分離的化合物只在床層 頂端區(qū)域輸入。 ? 隨著時(shí)間的延長，各組分從 進(jìn)料位置開始在環(huán)狀床層內(nèi) 形成螺旋形譜帶。