【正文】 wise elution)。 線性梯度洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相的離子強(qiáng)度線性增大，因此溶質(zhì)分配系數(shù)連續(xù)降低，移動(dòng)速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì) B在較小的流動(dòng)相體積下洗脫。 線性梯度洗脫過(guò)程中溶質(zhì) A和 B 在 IEC柱的移動(dòng)和洗脫曲線 溶質(zhì)的移動(dòng)速度不斷增大，直至與流動(dòng)相流速相同 (m→ 0) 改變流動(dòng)相離子強(qiáng)度的增大速度 (即濃度梯度 )，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在改善分離度的同時(shí)縮短洗脫時(shí)間。 IEC的應(yīng)用及特點(diǎn) IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于 IEC基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性，而且選擇性遠(yuǎn)高于 GFC。 IEC柱： 75 ， TSK ge1 SP—5PW； A液： ／ L磷酸鹽／乙腈 (70／ 30)， ； B液： ／ L磷酸鹽／乙腈 (70／ 30)， ； 梯度：線性 A→ B(30min)；流量＝ ／ min； 圖中： 1–催產(chǎn)肽； 2–腦啡肽； 3–TRH； 4 –α–內(nèi)啡肽； 5 – LHRH ； 6–神經(jīng)降壓素； 7–αMSH； 8 –血管緊張肽 II； 9–P物質(zhì)； 10–β內(nèi)啡肽 IEC分離激素多肽 親和色譜 (Affinity Chromatoraphy， AFC) 親和色譜 是專門用于純化生物大分子的色譜技術(shù)。它基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來(lái)進(jìn)行分離。 其顯著特點(diǎn)是 高選擇性 ，且色譜過(guò)程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。 親和色譜被廣泛用于酶、治療蛋白、抗體、核酸、輔助因子等生物大分子以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等超分子物質(zhì)的分離與純化。 親和色譜操作示意圖 (● 目標(biāo)產(chǎn)物， ?雜蛋白 ) 根據(jù)選擇性的高低，可將親和色譜分為 專一性 和 基團(tuán)性 兩類。前者的配基僅對(duì)某種生物物質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性，如單克隆抗體對(duì)抗原的特異性吸附就屬此類。后者則指固定相配基對(duì)一類基團(tuán)有極強(qiáng)的親和關(guān)系，如一些輔酶 (NAD+， NADP+， ATP等 )能與許多需要這些輔酶才起催化作用的酶發(fā)生親和結(jié)合。 親和載體選擇性好， 但不是任何生物高分子都有特定配基。針對(duì)某一生物大分子的分離，需要制備專一的配基，并選擇特定的色譜條件。這使親和色譜吸附劑的商品化受到限制。 親和色譜所用固定相載體是由對(duì)生化物質(zhì)有特異親和力的配位體偶聯(lián)在惰性載體上構(gòu)成。載體制備過(guò)程一般包括 3步，即載體 (基質(zhì) )的選擇、載體的活化和配基的連接。 親和色譜載體 國(guó)際知名牌號(hào)的親和色譜載體基質(zhì)： 美國(guó) Amicon公司的 Matrex CellufineTM(交聯(lián)纖維系 ) 法國(guó) IBF公司的 UltrogelR(聚丙烯酰胺／瓊脂糖 ) 英國(guó) Shandon公司的 Hyperil WP300TM(硅 ) 日本東洋曹達(dá)公司的 Toyopearl， 等等 載體基質(zhì)的特性對(duì)分離純化效果至關(guān)重要。 常規(guī)的親和色譜載體都是以軟質(zhì)凝膠，諸如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等作為載體材料的。這些載體材料雖然機(jī)械強(qiáng)度較差，傳質(zhì)速率低，但在生物技術(shù)領(lǐng)域中仍被廣泛采用。 親和色譜中常用一些小分子化合物作為配基制備親和載體，但小分子的配基直接連接于瓊脂糖上常產(chǎn)生無(wú)效吸附劑，其原因是由于載體的空間位阻關(guān)系，使大分子化合物 (親和物 )不能直接接觸到配基。解決的辦法是在載體和配基之間引入適當(dāng)長(zhǎng)度的“手臂” (間隔基 )，以減少載體的空間位阻，增加配基的活動(dòng)度。作為“手臂”的烴鏈可以先連接于載體，再通過(guò)它連接于配基上。 親和色譜中引入 “ 手臂 ” 原理 親和色譜一般采用柱色譜法。洗脫方法有兩類：普通洗脫法和專一性洗脫法。 與其他色譜分離一樣，可通過(guò)改變?nèi)軇┗蚓彌_液的類型，改變緩沖液的 pH和離子強(qiáng)度，改變洗脫溫度，以及添加促溶劑等措施進(jìn)行洗脫。 親和色譜操作和應(yīng)用 親和色譜分離在生物制品分離和分析領(lǐng)域有寬廣的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景 。 應(yīng)用親和色譜分離技術(shù)分析血液中纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原的含量 ， 所用的載體基質(zhì)為 Toyopearl HW65(粒徑20～ 40μm， 排除相對(duì)分子質(zhì)量 5 106Da)， 使用甘氨酰酞替甘氨酸作隔離體 ， 而固定化配位體為 p氨基苯酰脒 。 其色增分析系統(tǒng)如圖所示 。 用免疫親和色譜柱純化干擾素，產(chǎn)品純度比原用方法提高近 10倍。 親和色譜分離纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原分析系統(tǒng)圖 1–切換閥門； 2 –泵 (1ml／ min)； 3 –調(diào)節(jié)閥； 4 –壓力表； 5 –注樣器； 6 –過(guò)濾器； 7 –色譜柱 (25—30℃ )； 8 –螢光檢出器 (蛋白質(zhì)用 )； 9 –集樣器 (4℃ )； 10 –兩點(diǎn)記錄儀； 11 –蠕動(dòng)泵； 12 –壓力表； 13 –反應(yīng)盤管 (37℃ )； 14 –螢光檢出器 (酶活性測(cè)定定用 ) 高效液相層析（ HPLC） ? 特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 ? 許多類型的柱層析都可用 HPLC來(lái)代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。 高效液相色譜儀 Fermentation Culture supernatant Centrifugation to remove cells Liquid preparation to animal feed market Fermentation Culture supernatant Fermentation Cell pellet Intracellular fraction Animal feed enzyme Analytical enzyme Therapeutic protein Centrifugation to remove cells Centrifugation to remove medium Protein precipitation Cell lysis amp。 Centrifugation Protein fraction Protein precipitation Protein fraction 1 or 2 purification steps Semipurified protein 34 purification steps Homogeneous protein Sterile bottling To pharmaceuticals market Lyophilisation Bottling To chemicals market C 細(xì)胞 膜蛋白質(zhì) 1．為什么說(shuō)色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)中最高的 ? 2．各種色譜分離 (吸附、分配、離子交換、凝膠、親和 )的機(jī)理是什么 ? 3．分析色譜與制備和工業(yè)色譜的主要區(qū)別是什么 ? 4．色譜分離中吸附劑的基本要求是什么 ?常用色譜載體基質(zhì)材料有哪些 ? 5 ．親和色譜載體中引入“手臂”的原理是什么 ? 6．含有 3種溶質(zhì) A、 B、 C的混合液，它們與固定相的作用力依次增強(qiáng) (即 A＜ B＜ C)，其濃度分別為 A： ％、 B： ％、 C： ％。試分別繪出采用洗脫展開(kāi)法、前沿分析法和置換展開(kāi)法操作時(shí)的流出曲線圖。 思 考 題