【正文】 流速 （ 操作壓 、 型號 、粒度 ） 。 ? 分部收集器 。 151 （三）凝膠柱的再生 ? 反沖 。 ? 重新裝柱 。 152 四、主要參數(shù)測算 ? V0及 Vi的測算 ? Kd及 Kav的值 ? 分辨率 R 153 （一） V0及 Vi的測算 ? 1． 重量法 ? Vt=Vo+Vi+Vg =π /4d2h Vi=gWr ? Vo=Vt－ （ Vi+Vg） Vg估算為 1cm3/g干膠 。 ? 2． 過柱法 ? 已知物質(zhì)的洗脫體積 Ve=Vo+KdVi ? 如用全滲入 （ Kd=1） 或全排阻 （ Kd=0） 的物質(zhì)過柱 ，測量其洗脫體積 ， 計算該凝膠柱的 V0值及 Vi值 。 ? 常用藍(lán)色葡聚糖 （ Kd=0） 及重鉻酸鉀 （ Kd=1） 。 154 （二）分配系數(shù)測定 ? 分配系數(shù) ? 當(dāng)測得某物質(zhì)的 Ve及 Vt ， 內(nèi)水體積 Vi及外水體積 V0時 ， 算出 Kd及 Kav的值 。 ? Kd及 Kav Ve被認(rèn)為是一種組分對于某一個凝膠柱的特征常數(shù) 。 155 （三）分辨率 ? 凝膠層析中 ， 兩物質(zhì) （ A和 B） 和分辨率 （ R） 定義為： ? ? 當(dāng) R值＞ 1， 兩物質(zhì)完全分開 ， 小于 1時則不能完全分離 。 ? 分離時 較大柱床體積 可增大 △ Ve 。 ? 減少 （ WA+WB） 的方法是 適當(dāng)濃縮樣品 、 選用小粒度凝膠 、 流速適當(dāng)減慢 等 。 156 五、凝膠層析的擴(kuò)展 ? （一）上行凝膠層析 利用流動和重力方向相反的上行層析法，即 洗脫液向上流動 的層析法。 ? 反轉(zhuǎn)柱 ? （二）增加有效床高 提高分辨率 ? （ 1）串聯(lián)層析 ： 有效柱長 ? （ 2）循環(huán)層析：即在同一根或兩根柱上，樣品反復(fù)進(jìn)行層析。 157 循環(huán)層析 圖 人血漿藍(lán)蛋白的循環(huán)層析分離 柱：交聯(lián)葡聚糖凝膠 G100， 93cm；樣品： （ 3%）；流速： 20ml/h； 洗脫液： （含 NaCl） 簡單的循環(huán)層析裝置 選擇閥用于選擇待循環(huán)液或廢液，樣品從 A→D 上柱，經(jīng) B→D 洗脫，經(jīng)檢出的廢液由 E→C 排出， 需循環(huán)的物質(zhì)由 E→D 進(jìn)入層析柱。 158 （三）薄層凝膠層析 ? 用交聯(lián)葡聚糖作為薄層層析的支撐載體，稱“ 薄層凝膠層析 ” 。 ? 僅適用于分析 。 ? 特點(diǎn)： ? 生化分析； ? 設(shè)備簡單 ， 操作方便 ， 分離迅速 ； ? 分辨率高； ? 同一薄板可同時分析數(shù)個樣品； 159 第四節(jié) 色譜峰變寬的問題 ? 樣品的洗脫曲線不是一個窄的矩形峰，而是一個較寬的高斯峰。 ? 洗脫曲線： ? 樣品的分子量分布， ? 儀器造成的峰加寬效應(yīng)。 160 一、溶液通過 色譜柱 造成的峰加寬 ? Giddings提出的無規(guī)則行走模型 。 ? 溶質(zhì)分子本身的運(yùn)動是無規(guī)則的 。 ? （ 一 ） 分子擴(kuò)散 ? （ 二 ） 渦流擴(kuò)散 ? （ 三 ） 流動相中傳質(zhì)阻力 ? （ 三 ） 固定相中傳質(zhì)阻力 161 （一）分子擴(kuò)散 ? 濃度梯度 ? (HETP)d=2γDm/V ? （ HETP） d—溶質(zhì)分子縱向擴(kuò)散對塔板高度的貢獻(xiàn) ? γ—擾動因子 ， 表示柱內(nèi)填料對于溶質(zhì)分子擴(kuò)散的擾動作用 。 ? Dm—是溶質(zhì)分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)； V—流速 。 ? (1)小而均勻的填料 ? (2)適當(dāng)?shù)娜軇? ? (3) 提高流速 162 （二）渦流擴(kuò)散 ? 與填料顆粒的形狀 ， 尤其是顆粒尺寸有關(guān) 。 ? (HETP)e=2λ dp ? dp—填料顆粒的直徑； ? λ —是與填料及裝填有關(guān)的常數(shù) 。 ? (1)小而均勻的填料 ? (2)粒度一致且裝得均勻 163 （三）流動相中傳質(zhì)阻力 ? 流動相在柱中的流速是不均勻的 。 ? 溶質(zhì)分子有流速的梯度而導(dǎo)致溶質(zhì)分子的濃度梯度 ， 徑向擴(kuò)散 。 ? （ HETP） m=ωd2pV/Dm ? (1)填料裝得規(guī)整 、 緊密 。 ? (2) 采用粒度小的填料； ? (3)降低流速； ? (4) 選用合適的溶劑 （ 溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)較大 ） 。 164 （四）固定相中傳質(zhì)阻力 ? 在色譜柱中溶質(zhì)分子的一部分 F在流動相中 ，而另一部分 （ 1—F） 在固定相中 。 ? 分子從固定相中脫離出來到流動相中去 ， 而另一些分子則從流動相進(jìn)入固定相中 。 ? 結(jié)果： ? （ 1） 溶質(zhì)層變寬 ； ? （ 2） 溶質(zhì)層作為一個整體以 FV的速度運(yùn)動 。 165 色譜柱內(nèi)造成的峰加寬 ? 填充介質(zhì)粒度越小 ,峰加寬效應(yīng)越小 。 166 溶液在柱外產(chǎn)生的峰加寬 ? （一）連接管路 ? 當(dāng)液體流經(jīng)細(xì)管時，徑向速度梯度使矩形溶液脈沖變成拋物面形，并導(dǎo)致濃度的徑向梯度。 ? 減小管徑 ? （二）檢測池 167 二、峰寬的表示方法 ? W是峰寬 ， 它是通過曲線的兩個拐點(diǎn)的切線和基線交點(diǎn)之間的距離 。 ? 拐點(diǎn)之間的距離等于 2δ， δ稱為峰的標(biāo)準(zhǔn)偏差 。 ? δ是衡量峰的寬度的量 。 ? W=4δ 168 分離效果 —分離度 ? 分離效果用兩個峰的峰尖距離以及兩個峰的峰寬來表示 。 ? 分離度 Rs的定義為： ? 選擇性 決定 分離能力 ， 表現(xiàn)在兩個峰之間的距離上； ? 柱效 決定峰的擴(kuò)張程度 ， 表現(xiàn)在峰寬 W和標(biāo)準(zhǔn)偏差 σ上 。 169 ? 分離能力： ? 填料顆粒的 孔徑 大小 ? 孔徑分布 ? 溶質(zhì) 分子量分布 . ? 柱效： ? 溶質(zhì)分子的擴(kuò)散 ? 填料的粒度和分布 ? 填料顆粒的幾何形狀 ? 柱子的尺寸 ? 流速 170 第五節(jié) 凝膠層析的應(yīng)用 一、脫鹽和濃縮 二、分子量測定 三、分離純化 171 一、脫鹽和濃縮 ? 脫鹽 用的凝膠多為 大粒度 的 ， 高交聯(lián)度 的凝膠 。 ? 交聯(lián)度大 ， 凝膠顆粒強(qiáng)度好；凝膠粒度大 ，流速高 。 ? 樣品體積最好小于內(nèi)水體積的三分之一 。 172 濃縮 ? 采用包埋法 ? 直接投入法 173 二、分子量測定 ? 在凝膠的分離范圍內(nèi) ， 不同分子量的物質(zhì)其 洗脫體積 Ve及分配系數(shù) Kd值隨分子量增加而下降 。 ? 對于一個特定凝膠柱 ， 待測定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式 ? Ve=KlogM+C 174 分子量的測定 ? （ 1）求解法 :（兩個已知分子量的蛋白質(zhì)過柱） ? Vel=C－ KlogM1 ? Ve2=C－ KlogM2 ? （ 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 :（先以 3個以上已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱 ） : ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線法準(zhǔn)確性較高 175 Ve與分子量的關(guān)系 圖 一些球蛋白分子量與 Ve的關(guān)系 柱： 40 ；洗脫液； （含 ） 1．大豆胰蛋白酶抑劑； 2．細(xì)胞色素 C二聚體； 3．胰凝乳蛋白酶原； 4．卵清蛋白； 5．血清白蛋白； 6．血清白蛋白二聚體； 7． γ球蛋白； 8．甲狀腺球蛋白； 9．蔗糖； 10．胰高血糖素； 11．細(xì)胞色素 C5611； 12．細(xì)胞色素 C5611； 13．核糖核酸酶； 14． α乳清蛋白； 15．肌紅蛋白 176 三、凝膠層析在生化制藥中的應(yīng)用 ? （ 一 ） 去熱原 ? 吸附的專一性不強(qiáng) 。 ? 對 SephadexG25來說 ， 氨基酸Kd值等于 1， 熱原性物質(zhì) Kd值都等于 0。 177 （二）分離純化 ? SephadexG50純化胰島素 ， 除去胰島素中前胰島素和其它大分子抗原物質(zhì) 。 ? 凝膠離子交換劑 。 ? DEAESephadexA 50精制透明質(zhì)酸酶 。