【正文】 紅細(xì)胞在毛血細(xì)管中流動時比血漿流得快 . ? 較大的分子較先通過或繞過這個填料顆粒，使溶質(zhì)能按其大小進行分離。 ? 平衡條件只是在流速很慢時的一個極端情況 。 ? VA=V1+V0+VGM 99 100 原理 ? 當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時 ， 較小的分子在柱中停留時間比大分子停留的時間要長 ， 于是樣品各組分即按分子大小順序而分開 ，最先淋出的是最大的分子 。 98 第一節(jié) 凝膠層析的基本原理 ? 凝膠層析的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進行的 。 90 四、大孔網(wǎng)狀吸附劑的實驗操作 （一）、大孔吸附樹脂的選擇 預(yù)處理 甲醇、乙醇、丙酮洗滌至洗出液加水不渾濁 靜態(tài)吸附 動態(tài)吸附 91 （二）、吸附條件選擇 樣品濃度 pH值、鹽濃度 流速（吸附時間） （三）、洗滌 （四）、洗脫 流動相選擇 流速 92 五、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑應(yīng)用 應(yīng)用廣泛，如四環(huán)素、土霉素、竹桃霉素、 紅霉素 、林可霉素、麥迪霉素、赤霉素、維生素 B12及頭孢菌素 C等 93 紅霉素的分離純化 94 SIP1300大孔吸附劑分離純化超氧化物歧化酶 95 頭孢菌素 C 第七章 凝膠層析 (Gel chromatography) 96 97 凝膠層析 (Gel chromatography) ? 分子篩層析 、 凝膠擴散層析 、 排阻層析 、 限制擴散層析等 。選用溶劑應(yīng)容易 溶解吸附物 。 ? 水溶液中，一般分子量越大，極性越弱，吸附量就越大。 ? 而中等極性的吸附劑則對上述兩種情況都具有吸附能力。 85 Amberlite大網(wǎng)格吸附劑的物理性質(zhì) 86 Diaion大網(wǎng)格吸附劑的物理性質(zhì) 87 二、 大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑吸附機理 ? ―類似物容易吸附類似物”的原則： ? 一般 非極性吸附劑 適宜于從極性溶劑 (水 )中 吸附非極性物質(zhì) 。 84 一、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑的類型和結(jié)構(gòu) 可分為 非極性、中等極性、極性和強極性吸附劑 四類。 其孔隙大小、骨架結(jié)構(gòu)和極性，可按照需要，根據(jù)不同的原料和合成條件而改變，因此可 適用于吸附各種有機化合物 。 82 第三節(jié) 大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑 大網(wǎng)格吸附劑 (macroreticular adsorbent ) （大孔網(wǎng)狀樹脂， macroreticular resin ） 在樹脂聚合時加入惰性的 致孔劑 ，待網(wǎng)格骨架固化和鏈結(jié)構(gòu)單元形成后，用溶劑萃取或蒸餾水洗將致孔劑去掉，形成不受外界環(huán)境條件影響的孔隙，其孔徑遠(yuǎn)大于 2～ 4nm，可達(dá)100nm，故稱 “ 大孔 ” 。 [ 層 析 ] [ 洗 脫 ] [ 冷凍結(jié)晶 ] 維生素 B 12 —————— → 吸附柱層析 ———— → 洗脫液 ————— → 維生素 B 12 結(jié)晶 的濃縮液 Al 2 O 3 吸附 ,2 0 ℃ 以下 丙酮 , 水 (8 0 % ) 丙酮 5~6 倍 (4 0 0 0 u /m l) 81 活性炭為吸附劑 ? 洗脫劑從極性高的開始 逐漸降低極性 。 ? 常用洗脫劑排序（極性增大）： 石油醚 甲苯 乙醚 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸 80 氧化鋁或硅膠為吸附劑 ? 洗脫劑從極性低的開始 逐漸增加極性 。nH2O 硅膠表面的硅羥基能吸附多量的水，稱自由水， 活性隨自由水含量增加而下降 。 75 六、氧化鋁 (Aluminum oxide) 適用于親脂成分的分離 堿性氧化鋁： 中性氧化鋁： 酸性氧化鋁： 76 氧化鋁吸附層析純化維生素 B12 影響因素： (1) Al2O3的顆粒度要均勻 ， 流速控制要很慢； (2) 溫度宜在 20℃ 以下層析 ， 洗脫在室溫中進行； (3)利用 B12在丙酮中不溶的特性 ， 在冰凍條件下結(jié)晶 3天 ， 結(jié)晶析出 。xSiO2 吸附劑用量 。 59 二、吸附類型 物理吸附 化學(xué)吸附 作用力 吸附熱 選擇性 吸附速度 吸附分子層 范德華力 較小 ,接近液化熱 幾乎沒有 較快 ,需要的活化能很小 單分子或多分子層 化學(xué)鍵力 較大 ,接近反應(yīng)熱 有選擇性 慢 ,需要一定的活化能 單分子 60 三、影響吸附的因素 （一）吸附劑 吸附容量： 比表面積 、種類、 活化狀況 吸附速度： 顆粒度 、孔徑 機械強度 61 （二）吸附物 能使表面張力降低的物質(zhì)，易為吸附 溶解度：較小易吸附 極性吸附劑易吸附極性吸附物 同系物吸附量變化有規(guī)律 氫鍵 62 吸附劑及被吸附物極性對吸附的影響 ? 極性吸附劑易吸附極性物質(zhì) ， 非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)； ? 極性吸附劑適宜從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)； ? 非極性吸附劑適宜從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì) 。 (2)一些無機吸附劑性能不穩(wěn)定。 (2)少用或不用有機溶劑 ， 吸附過程中 pH變化小 ，較少引起 生物活性 物質(zhì)的變性失活 。 第六章 吸附分離法 54 55 ? 吸附法 (adsorption method)指利用吸附作用，將樣品中的 生物活性物質(zhì) 或 雜質(zhì) 吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑對活性物質(zhì)和雜質(zhì)間 吸附能力 的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。 ?將溶質(zhì)溶于一種溶劑中，然后將第二種溶劑加熱后緩緩地加入，放置一段時間使結(jié)晶完全 。 重結(jié)晶： 即將晶體用合適的溶劑溶解再次結(jié)晶 。 50 （二）、晶體形狀 改變晶體外形，可用 :選擇不同的溶劑、 控制過飽和度、 結(jié)晶溫度 、調(diào)節(jié)溶液的 pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。 （九）、共沸蒸餾結(jié)晶 46 等電點法 47 化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 48 綜合利用 49 三、提高晶體質(zhì)量的途徑 工業(yè)上通常希望得到 粗大而均勻 的晶體，便于過濾與洗滌。 (3) 晶體生長。 C2 — 小晶體的溶解度 ； C1 — 普通晶體的溶解度； ρ — 晶體密度； M — 晶體質(zhì)量； σ — 晶體與溶液間的界面張力； γ 2 — 小晶體的半徑 ； γ 1 — 普通晶體的半徑； 39 )11(2ln1212rrRTMCC ????結(jié)晶包括三個過程： (1) 形成 過飽和溶液 。 ? 通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到 純度高 的晶體。 33 34 胰蛋白酶提取工藝 四、 高分子聚合物沉淀 水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（ PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使 蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀 。 28 ? 胰島素純化： 胰島素 pH8 除去堿性雜蛋白 pH3 除去酸性雜蛋白 金屬離子沉淀：與生物分子的 酸性功能團 作用的 金屬復(fù)合鹽法 ； 有機酸類復(fù)合鹽沉淀 :與生物分子的 堿性功能團 作用的 有機酸復(fù)合鹽法 （如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。 蛋白質(zhì)濃度 %～ 2%； 粘多糖濃度 1%～ 2%。 胰島素精制： 26 （五）某些金屬離子的助沉淀作用 （六）樣品濃度 濃度小時，增加溶劑投入量和損耗。 高鹽 ：增大蛋白質(zhì)在有機溶劑 ― 水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。 24 （三）溫度（低溫沉淀） 有機溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。 23 二、影響沉淀效果的因素 （一）有機溶劑