【正文】 種類及用量 常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。 21 一、基本原理 一些溶劑的介電常數(shù) 22 有機溶劑沉淀法 ? 優(yōu)點： 乙醇等有機溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。 20 降低了介質的 介電常數(shù) ，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。 將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。 碳氧肌紅蛋白 （四）溫度的影響 13 210log S2 3 4 μ25 ℃0℃p H 6 . 6溫度的變化會影響 ?值 在無鹽或稀鹽溶液中 ， 大多數(shù)蛋白質溶解度 是隨溫度升高而增大的 ， 但在 高鹽溶液中常相反 （五） pH的影響 ? 當溶液的 pH在蛋白質等電點附近時， ?值最小。 8 （一）、無機鹽的種類 鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強 ， 陰離子的鹽析效果比陽離子好 ， 尤其以高價陰離子 更為明顯 。 ? 兩種類型： （ 1）在一定的 pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析，稱作 Ks鹽析法 。 7 2 . 52 . 01 . 51 . 00 . 500 . 51 . 01 . 51 2 3 4 5 6βμlogSS0?、 KS ? ?為縱坐標上的截距， 是外推截距 ，與無機鹽種類無關。 6 在鹽析區(qū)，符合公式 logS=?Ks? S——蛋白質溶解度 ， g/L； ?—鹽離子強度 , Ci——i離子濃度 ， mol/L； Zi——i離子化合價； ?——常數(shù) ,為縱坐標上的截距 。 優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟、較少變性 缺點：分辨率不高，要除鹽 3 兩種現(xiàn)象： 鹽溶 ：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質溶解度增大 鹽析 ：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質 溶解度減小 4 2 . 52 . 01 . 51 . 00 . 500 . 51 . 01 . 51 2 3 4 5 6βμlogSS0一、基本原理 5 原理 ? 形成 離子對 ，部分中和了蛋白質的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。第五章 固相析出分離法 ? 通過改變溶液條件，使溶質以固體形式從溶液中分出的操作技術。 ?鹽析法 ?有機溶劑沉淀法 ?等電點沉淀法 ?結晶法 2 第一節(jié) 鹽析法 (salt precipitation) 定義：鹽析法是利用各種生物分子 在濃鹽溶液中溶解度的差異 ，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使 目的物或 雜蛋白 以沉淀 析出 ，達到純化目的的方法。 ? 中性鹽的親水性比蛋白質大，使蛋白質脫去了 水化膜 ，使其沉淀。 Ks——鹽析常數(shù) 。 ? KS是鹽析常數(shù) ，與蛋白質和鹽的種類有關，但與溫度和 pH無關。 （ 2）在一定離子強度下僅改變 pH和溫度進行鹽析，稱作 β 鹽析法 。 PO4 3＞ SO42― ＞ CH3COO― ＞ Cl― ＞ NO3― ＞ I― NH4+＞ K+＞ Na+＞ Li+ 鹽析用鹽常用硫酸銨 9 二、影響鹽析的因素 (二）溶質（蛋白質等）種類的影響 血纖維蛋白原碳氧血紅蛋白血清白蛋白擬球蛋白碳氧肌紅蛋白μ0 . 5 000 . 5 01 . 0 00 2 4 6 8 1 0log S10 鹽析分布曲線 11 （三）蛋白質濃度的影響 12 d dS P1098765432104 0 5 0 6 0 7 0 8 0P3 0 g / L 3 g / L蛋白質濃度提高，鹽用量減少。 ? 利用 ?值最低點時 pH的不同，可以分級沉淀蛋白質 . 14 卵清蛋白碳氧血紅蛋白765432103 4 5 6 7 8pHβ三、鹽析操作 （一）鹽析用鹽的濃度表示 固體粉末 硫酸銨飽和溶液 常用 “ 飽和度 ” 來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度， 25℃ 時 (NH4)2SO4的飽和濃度為 mol／ L，定義它為 100%飽和度 . 15 （二）鹽析方法和注意事項 分部鹽析法 重復鹽析法 反抽提法 一定的鹽濃度下將 目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀 。 16 分部鹽析法 17 反抽提法 (RNA聚合酶 ) 18 注意事項 ? “局部過濃 ” ?溫度 （室溫） ?分離方法 19 第二節(jié) 有機溶劑沉淀 (Organic Solvent Precipitation) ? 定義：向水溶液中加入一定量 親水性 的有機溶劑，降低溶質的 溶解度 ，使其沉淀析出的分離純化方法。 水溶性有機溶劑本身的 水合作用 降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質分子表面原有 水化層的厚度 ，降低了它的親水性，導致脫水凝集。 ? 缺點： 容易使蛋白質變性，操作常需低溫，成本高，需 防火防爆 。 （二） pH的影響 許多蛋白質在等電點附近時溶解度最低，溶液 pH應在 等電點附近 ，還須考慮蛋白質的穩(wěn)定性。 （四）無機鹽的含量 低鹽：有利于沉淀，還有保護蛋白質，防止變性。 25 多價陽離子，如 Ca2+、 Zn2+能與蛋白質結合形成復合物，使蛋白質溶解度降低。 濃度大時，增加共沉作用，降低分辨率。 27 第三節(jié) 其它沉淀方法 一、等電點沉淀法 對于兩性物質，等電點時凈電荷為零， 分子間排斥電位降低 ，吸引力增大，能相互聚集起來，發(fā)生沉淀。 29 二、成鹽沉淀法 1．金屬離子沉淀： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Zn2+、 Ca2+、Ba2+、 Mg2+等； 2．生成有機酸類復合鹽沉淀 （ 1）丹寧即鞣酸 （ 2） 雷凡諾 （ 3） 三氯乙酸 （ TCA） 30 雷凡諾 ? 31 豬心提取液 洗脫液 上清液 上清 細胞色素 C 沉淀（去除） 32 吸附 人造沸石 鹽析 45%飽和硫酸銨 沉淀 TCA 透析 豬心中提取細胞色素 C的工藝 三、親和沉淀 利用親和反應原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成 載體 配基復合物（親和沉淀劑） ，該復合物可選擇性地與蛋白質結合，在一定條件下沉淀出來。 五、表面活性劑 十六烷基三甲基季胺溴化物（ CTAB） 十六烷基氯化吡啶（ CPC） 35 } 酸性多糖 36 六、選擇性變性沉淀法 ? 熱變性沉淀法 ? 酸堿變性沉淀法 ? 利用試劑（氯仿） 37 第四節(jié) 結晶 (crystallization) ? 定義： 溶液中的溶質在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結合成晶體。 38 一、結晶過程 指溶質自動從 過飽和溶液 中析出形成新相的過程 。 (2) 晶核形成 。 40 濃度溫度圖 41 二、過飽和溶液的形成 (結晶方法 ) （一）、蒸發(fā)法 （二）、 溫度誘導法 （三）、 鹽析結晶法 （四）、 透析結晶法 （五）、有機溶劑結晶法 42 溫度誘導法 43 鹽析結晶法 44 透析結晶法 45 （六）、 等電點法 （七）、微量擴散法 （八