核酸分離純化技術(shù)ppt課件-展示頁(yè)
2025-05-10 01:09本頁(yè)面
【正文】 ② 壓力差破碎法：通過(guò)壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎。 常用的物理破碎方法有： ① 溫度差破碎法：利用溫度的突然變化，細(xì)胞由于熱脹 冷縮的作用而破碎。 2．物理破碎法 通過(guò)溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，稱為物理破碎法。 三．核酸的分離提取 大致步驟： １ .收集細(xì)胞 ２ .破碎 裂解細(xì)胞（或細(xì)胞器） ３ .解聚核蛋白并去除蛋白質(zhì) ４ .沉淀核酸并去除其他雜質(zhì)（純化）。 對(duì)于 RNA酶： 其具有高穩(wěn)定性，抗酸抗堿，具很廣的 pH作用范圍，抗高溫嚴(yán)寒（ 0~65℃ 均具有活性）。 內(nèi)源性 RNA酶：組織本身所固有的，在某些組織中（如胰腺），或者在其特定的生理狀態(tài)（如快速發(fā)育期間）下的含量很高。因此只要加入 EDTA（乙二胺四乙酸），螯合劑就可以基本上抑制 DNA酶的活力。在提取緩沖液中加入蔗糖或山梨糖醇等增加溶液的滲透壓。 ? ２ .減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解 ＰＨ４－１０，避免酸堿對(duì)核酸的磷酸二脂鍵的破壞 3?, 5?磷酸二酯鍵 溫度： 最適溫度 ４ ℃ 防止機(jī)械剪切力的作用： 基因組 DNA：分子細(xì)長(zhǎng)，容易受到機(jī)械剪切力的作用而斷裂，所以機(jī)械剪切作用是分離DNA時(shí)的主要危險(xiǎn)。 油菜葉片總 RNA的非變性電泳（ A ）和甲醛變性電泳（ B ）結(jié)果 二．分離純化核酸時(shí)的注意事項(xiàng) 要得到具有生物活性的核酸大分子，在分離時(shí)必須避免核酸變性，并盡可能保持分子的完整性，避免降解。原核生物 DNA集中在核質(zhì)區(qū)， RNA分散在細(xì)胞質(zhì)里。 分布： 真核生物的 DNA主要存在于細(xì)胞核中，只有約 5%在線粒體、葉綠體等細(xì)胞器中。至于病毒、類病毒所含的 DNA和 RNA分子則形式多樣，有雙鏈線狀、雙鏈環(huán)狀、單鏈線狀、單鏈環(huán)狀等。而且，不同類型的 RNA還有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 ? 基本技術(shù)： ? （一）核酸分子雜交 ? （二）聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） ? （三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè) ? （四）限制酶酶譜分析 ? （五） DNA序列測(cè)定 ? （六） DNA芯片技術(shù) 第一節(jié) 核酸的分離與純化 ? 意義：實(shí)驗(yàn)的第一步工作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基本保障 ? 原則： ? 保證一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 ? 排除其它大分子的污染 要求： 、多糖、脂類分子污染 一、首先了解核酸的存在狀態(tài)及分布： 形狀：真核生物染色體 DNA是雙鏈線狀，其細(xì)胞器 DNA以及原核生物 DNA，質(zhì)粒DNA等都是雙鏈環(huán)狀?；蛟\斷技術(shù) 基因診斷 (gene diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 ， 在 DNA水平分析基因的存在 、 鑒定疾病所涉及基因的置換 、 缺失或插入等突變 ， 以診斷各種感染性疾病和遺傳性疾病 ， 進(jìn)行腫瘤分子水平的研究 。 主要技術(shù)及過(guò)程 區(qū)分或鑒定 DNA的異常 分離、擴(kuò)增待測(cè)的 DNA片斷 基因探針的制備和標(biāo)記 ? 基因診斷的特點(diǎn) : ? 高度的特異性 ? 高度的靈敏性 ? 實(shí)現(xiàn)早期快速診斷 ? 被檢測(cè)基因不一定活化，可檢測(cè)表達(dá)差異基因。 多數(shù)生物體的 RNA分子是單鏈線狀。如真核生物 mRNA多數(shù)有 PolyA尾巴。無(wú)論 DNA還是 RNA，在體內(nèi)都形成一定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。 RNA則 75%左右存在于細(xì)胞質(zhì)中，約 15%在細(xì)胞器中，約 10%在核中。細(xì)胞質(zhì)各種 RNA中，以 rRNA的數(shù)量最多（約占 5%），tRNA其次（ 1520%）， mRNA最少（ 15%）。因此，要注意下列事項(xiàng)： １ .盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少變性降解的機(jī)會(huì)。 ３ .減少物理因素對(duì)核酸的降解 操作時(shí)動(dòng)作必須輕緩，攪拌時(shí)要溫和， 避免讓 DNA溶液通過(guò)狹窄的孔道 。 提取分子量較小，結(jié)構(gòu)又很緊密的 DNA，如小的細(xì)菌質(zhì)粒超螺旋 DNA等時(shí)，機(jī)械剪切力的威脅較小，操作時(shí)可不必過(guò)于謹(jǐn)慎 核酸酶直接破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)，必須抑制其活性 對(duì)于 DNA酶： 大多數(shù) DNA酶作用時(shí)需要二價(jià)金屬離子，如Ca2+, Mg2+等。 ４ .防止核酸的生物降解 無(wú)所不在的 RNA酶： 外源性 RNA酶： RNA制備過(guò)程中用到的玻璃和塑料制品、研究人員本身尤其是研究人員的手，以及分離過(guò)程中
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