醫(yī)藥衛(wèi)生]層析分離純化技術-展示頁
2025-01-13 04:55本頁面
【正文】 6 融合蛋白的咪唑 ? 酶切后的 GST 或 His 標記 ? 多余的鹽 /尿素 /鹽酸胍 ? 用 HiTrap? Desalting 將樣品轉(zhuǎn)移到另一種緩沖液中， . 儲存用或改變 pH 29 交換緩沖液和去鹽的柱子 ? 快速有效 ? 高處理量 ? 去鹽 , 交換緩沖液 , 去掉低分子量物質(zhì) 柱子 樣品體積 樣品洗脫體積 MicroSpin? G25 ml ml HiTrap? Desalting ml ml HiPrep? 26/10 Desalting ml ml 30 交換緩沖液和去鹽的柱子 HiTrap? Desalting 咪唑在鹽峰中一并被去除 0 AU 280nm UV 280 nm 電導 (His) 融合蛋白 鹽峰 6 注射 (His)6 融合蛋白 31 選擇純化設備 純化需要 MicroSpin? Syringe + 196。KTA? 系統(tǒng) ? 添加劑兼容 快速，重復性好和容易使用 18 HiTrap? Chelating 準備柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗 加樣 用平衡緩沖液沖洗柱子 廢液 收集 用洗脫緩沖液洗脫融合蛋白 收集組份 3 min 515 min 2 min 用平衡緩沖液平衡柱子 廢液 3 min 19 HiTrap? Chelating SDS PAGE Flo w through 加樣 結(jié)合液 洗脫液 結(jié)合液 A A 280 280 A A 405 405 Volume (ml) Eluted pool W ash kDa 14,4 1 2 3 4 5 6 7 8 樣品 : 5 ml大腸桿菌表達含 (His)標記 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶， GST(His)6 柱 : HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 結(jié)合緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 20 mM 咪唑 pH 洗脫緩沖液 : 1X 磷酸緩沖液 , 500 mM咪唑 pH 流速 : 2 ml/min, 312 cm/h 結(jié)果 : 洗脫 GST(His)6, 4 ml, A280: 總量 : mg 1: 低分子量標記 (LMW) 2: 樣品稀釋 1:20 3: 穿透稀釋 1:10 4: 沖洗液 5: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:20 6: 洗脫 GST(His)6,稀釋 1:10 7: GST 標準品 , mg/ml 8: LMW 20 Chelating Sepharose? Fast Flow 適合自行裝柱和放大 ? 每毫升填料可純化高達 12 mg 融合蛋白 ? 裝在 XK 空柱中和 196。g, 體積達 400 181。KTA? 平臺純化系統(tǒng)連接使用 ? 高流速 ? 兼容尿素，鹽酸胍等 11 GST 融合蛋白的檢測 檢測方法 注意 GST 96 孔板 ELISA 檢測試劑盒 適合篩選表達系統(tǒng)和層析組份 當表達蛋白的含量不明或需要高靈敏度 時特別有用 GST 酶測定檢測模組 快速測定；適合篩選用途 功能測定 可以有效評估純化出來的 GST 融合蛋白 的活性 ， 但可能需要自行設計和優(yōu)化 12 GST融合蛋白的檢測 檢測方法 注意 使用抗 GST 抗體和 高度特異 , 只檢測 GST 融合蛋白 ECL? 檢測系統(tǒng)的 使用適當濃度的二級 HRP標記抗體可以 免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉 ECL 檢測系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測能力 ECL 提供大部分重組表達應用所需的靈敏 度 需要更高靈敏度時使用 ECL Plus. SDSPAGE ＋ Coomassie? 提供分子量大小和 % 純度訊息 . 考馬氏染色或銀染 可檢測融合蛋白和污染物 . 13 GST 96孔板 ELISA 檢測試劑盒 ? 快速酶測定 ? 每塊板可檢測 50 樣品 ? 適合篩選表達系統(tǒng)和層析組份 14 (His)6 融合蛋白的純化和檢測 重組蛋白 His His His Ni2+ His His is His Ni2+ Ni2+ Ni2+ 15 任何規(guī)模純化都比較簡單 預裝柱 /填料 一次可純化 注意 融合蛋白的量 His MicroSpin? 〈 100 181。KTA? 系統(tǒng) ? 添加劑兼容 適合快速和重復性高的要求 8 GSTrap? 結(jié)合緩沖液平衡 加樣后用結(jié)合緩沖液沖洗 廢液 收集 用洗脫緩沖液洗脫 收集組份 3 min 515 min 2 min 9 GSTrap? SDS PAGE analysis 0 20 40 60 80 100 % Elution buffer 0 ml min Wash Elution buffer mg pure GST fusion protein A 280 kD 94 30 43 67 1 2 3 柱 : GSTrap 1 ml 樣品 : 8 ml 大腸桿菌表達含 GST 融合蛋白胞漿萃取液 結(jié)合緩沖液 : PBS, pH 洗脫緩沖液 50 mM Tris? HCl, pH ＋ 10 mM 還原谷胱甘肽 流速 : 1 ml/min 層析 步驟 : 4 CV結(jié)合緩沖液 , 8 ml 樣品 , 10 CV結(jié)合緩沖液 , 5 CV洗脫緩沖液 , 5 CV結(jié)合緩沖液 (CV = 柱體積 ) 系統(tǒng) : 196。g, 體積達400 181。1 層析分離純化技術 Shanghai Pudong 2 蛋白質(zhì)純化策略 融合蛋白質(zhì) 非融合蛋白質(zhì) 表達 簡單純化 一步 親和層析 90 97 % 純度 更高純度 三步純化策略 粗提 中度純化 精細純化 多步純化 3 簡易純化選擇 載體和標記 純化 pGEX 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 GST MicroSpin? Purification Module, GSTrap?, Glutathione Sepharose? Fast Flow PQE 6 x 組氨酸 His MicroSpin Purification Module pET HisTrap?, HiTrap? Chelating, 6 x組氨酸 Chelating Sepharose Fast Flow pEZZ 18 (非誘導性表達 ) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow pRIT2T (利用溫度改變誘導 ) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow 4 GST 融合蛋白的純化 GST 重組蛋白 酶切位點 Factor Xa: Mr 1720 000 /
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